利用光學相干斷層掃描血管造影分析PM2.5對小鼠角膜上皮和角膜全層厚度的影響

姜楠 ，劉啟 ，韓云 ，李娟 ，楊啟晨 ，王亞虹 ，袁晴，馬明洋，葉蕾，朱佩文，邵毅

（1.南昌大學第一附屬醫院 眼科，江西 南昌 330006；2.廈門大學 眼科研究所，福建 廈門 361102；3.陜西省西安市第四醫院 眼科，陜西 西安 710004；4.陜西省西安市環境監測站，陜西 西安 710054）

近年來環境污染引起人們越來越多的關注，許多研究表明環境污染會損害人體健康。PM2.5是評估環境污染中空氣污染嚴重程度的指標之一。PM2.5指的是大氣空氣動力學中的大氣懸浮顆粒，直徑＞2.5 μm[1]。其主要來自于燃料[2]。復雜復合物燃燒，包括大量的有機物質（如苯二烯和多環芳烴）和大量的無機成分，如硫酸鹽、硝酸鹽和重金屬（如鉛和鎳）[3]。既往研究表明[4]，杭州公共場所的室內灰塵中多環芳烴的濃度占總顆粒物的71.5%，這與PM2.5成分一致。多環芳烴被公認為環境污染物，其有強致癌和誘變特性從而影響人體健康[5]。PM2.5不僅對呼吸系統和心血管系統有害，還能減少人的壽命。眼球最為直接與外界接觸的重要器官之一，PM2.5可能直接對其功能產生影響。流行病學和臨床研究都指出空氣污染對眼表有生物效應。TORRICELLI等做過關于PM2.5對71例司機眼表影響的調查，調查顯示該司機的淚膜破裂時間（break-up time，BUT）值比正常人低[6]。CAMARA等人研究火山灰的對眼的影響。組成該污染物的主要成分是PM2.5，研究發現該污染物會引起眼癢、異物感覺、流淚和燒灼等眼部癥狀，以及一些其他癥狀，如結膜充血、黏液分泌增多、圓錐角膜腫脹、眼瞼腫脹和結膜水腫[7]。筆者前期發現，PM10還可進一步破壞小鼠淚膜穩定性，并影響淚液膜的滲透，從而導致干眼的形成[8]。而PM2.5會導致角膜和結膜上皮細胞的炎癥反應，并改變黏液的表達[9]，而角膜上皮細胞的自我更新能力對眼表防御系統的完整性至關重要，因此進一步研究其對角膜上皮細胞損害的機制是尤為重要的。本文旨在應用光學相干斷層掃描血管造影（optical coherence tomography angiography，OCTA）分析PM2.5對角膜上皮和角膜全層厚度的影響，并討論PM2.5對角膜上皮影響機制，為PM2.5影響眼表功能提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物隨機選取BALB/c小鼠（18～21 g，6～8周齡，雄性）共32只64眼（廈門大學醫學院實驗動物中心提供），均為無特定病原體（SPF）級實驗動物，實驗前用裂隙燈顯微鏡檢查所有小鼠眼底，眼前節和眼底部均未發現異常，所有小鼠均生活在標準環境中：室溫（25±1）℃，濕度（60±10）%，給予12 h交替規律的明暗周期（早上8點至晚上8點）[10]，兩組食物及水源相同且充足。本研究經醫學院動物倫理委員會批準，且嚴格遵循《赫爾辛基宣言》，符合醫學倫理原則。

1.1.2 PM2.5的采集和滴眼液的制備PM2.5樣品由西安環境監測站提供，2015年10月1～31日于西安市超級站，采用武漢天虹儀表有限責任公司的TH16A四通道大氣顆粒物智能采樣儀，切割粒徑為2.5 μm，采用美國產Whatman聚四氟乙烯濾膜進行采樣。從上午10∶30到次日上午8∶30，每天進行連續22 h的取樣。將采集到的樣本用聚四氟乙烯濾膜修剪為1 cm×1 cm，浸潤在蒸餾水中，超聲振蕩3次，每次45 min。經過6層紗布過濾后，樣品進行真空冷凍干燥處理，所得到的樣品即為PM2.5混懸液，所含物質包括大量可溶的有機物（如苯二烯和多環芳烴）和大量不可溶的無機成分，如硫酸鹽、硝酸鹽和重金屬（如鉛和鎳），制備PM2.5滴眼液，用無菌PBS稀釋PM2.5樣品，濃度為5 mg/ml，然后進行超聲檢測。濃度控制在0.005%的兩組眼藥水（PM2.5和PBS）中加入保存劑苯扎溴銨。置入4℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗方法32只小鼠隨機分為實驗組（n=16）、對照組（n=16）兩組，體重、周齡匹配，雙眼為實驗眼。實驗組采用5 mg/ml的PM2.5滴眼液滴眼，對照組采用PBS滴眼液滴眼，每天4次。利用光學相干斷層掃描血管造影技術分別在干預前，干預后第1、4、7、10及14天對兩組小鼠角膜上皮和角膜全層厚度進行測量。所有小鼠在第14天數據測量后進行安樂死。

1.2.2 檢查方法所有實驗小鼠使用Angio Vue OCTA系統（Optovue，Inc.Fremont，CA）視網膜成像（Angio Retina模式）上的分頻幅去相關血管成像算法進行成像，并使用前段透鏡光學適配器鏡片。每次掃描以橫向分辨率為15 μm，軸向分辨率為5 μm，光束寬度為22 μm，光源以840 nm為中心進行。該儀器捕獲后續的橫斷面掃面（B-掃描），包含以每秒70 000次的慢性橫向的304×304 A掃描，其大約在3～4 s內構建3D掃描[11]，因為OCTA系統默認的聚集是針對視網膜，所以在測量角膜全層及角膜上皮厚度時要關閉自動聚焦功能[12]。收集所得數據，并利用兩種分區標準，利用系統軟件將角膜劃分為17個區域（以右眼的分區名稱命名），17分區法中角膜中心區域為角膜中央2 mm直徑范圍，內環、外環分別為角膜中央5 mm、6 mm直徑范圍。內環、外環各區域分別再劃分為上方（S）、鼻上（SN）、鼻側（N）、鼻下（IN）、下方（I）、顳下（IT）、顳側（T）及顳上（ST）8個方位（見圖1），測量各區域角膜上皮和角膜全層厚度。得到A和B各32眼的角膜上皮厚度數據，各組左眼數據經過翻轉后與右眼對應疊加。測得數據選擇具有最高信號強度指數的掃描圖進行分析。角膜厚度平均值指的是17個區域角膜厚度相加后除以17后的厚度。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組同一時間的厚度比較采用t檢驗，不同時間的厚度均數比較采用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5混懸液滴眼對小鼠角膜上皮不同區域厚度的影響

圖1 角膜上皮和角膜全層厚度的測量圖

兩組不同時間的角膜上皮各區域厚度，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同組間角膜上皮厚度比較，差異有統計學意義（FC2=19.352，FS5=21.261，FSN5=17.665，FN5=18.694，FIN5=16.614，FI5=19.123，FIT5=17.617，FT5=17.432，FST5=19.632，FS6=19.122，FSN6=18.315，FN6=19.228，FIN6=21.734，FI6=20.134，FIT6=17.231，FT6=20.137，FST6=21.714 ；PC2=0.034，PS5=0.022，PSN5=0.031，PN5=0.023，PIN5=0.028，PI5=0.038，PIT5=0.021，PT5=0.032，PST5=0.042，PS6=0.035，PSN6=0.036，PN6=0.037，PIN6=0.033，PI6=0.037，PIT6=0.028，PT6=0.039，PST6=0.043）；②不同時間的角膜上皮厚度比較，差異有統計學意義（FC2=29.313，FS5=26.321，FSN5=27.612，FN5=28.672，FIN5=26.984，FI5=29.124，FIT5=27.625，FT5=32.412，FST5=29.612，FS6=29.198，FSN6=28.912，FN6=32.122，FIN6=31.732，FI6=30.133，FIT6=27.222，FT6=32.142，FST6=32.535 ；PC2=0.031，PS5=0.021，PSN5=0.032，PN5=0.023，PIN5=0.022，PI5=0.018，PIT5=0.023，PT5=0.022，PST5=0.022，PS6=0.025，PSN6=0.026，PN6=0.031，PIN6=0.023，PI6=0.031，PIT6=0.021，PT6=0.036，PST6=0.023）；③兩組不同區域的角膜上皮厚度變化趨勢均有差異（FC2=9.312，FS5=7.351，FSN5=7.422，FN5=8.614，FIN5=6.164，FI5=9.234，FIT5=7.455，FT5=8.474，FST5=9.322，FS6=9.116，FSN6=8.544，FN6=9.642，FIN6=11.715，FI6=10.147，FIT6=11.222，FT6=10.107，FST6=8.172；PC2= 0.036，PS5=0.029，PSN5=0.037，PN5=0.033，PIN5=0.039，PI5=0.038，PIT5=0.033，PT5=0.035，PST5=0.029，PS6=0.039，PSN6=0.029，PN6=0.038，PIN6=0.029，PI6=0.039，PIT6=0.029，PT6=0.039，PST6=0.033）。干預第1天兩組間各區域角膜上皮厚度比較，差異無統計學意義（均P＞0.05），第4天起，與對照組比較，實驗組角膜上皮下部厚度的IT5、I5、IN5、IT6、I6及 IN6區域增厚（均P＜0.05），第7天起，與對照組比較，實驗組小鼠角膜上皮厚度所有區域均增厚（均P＜0.05）。第10天、第14天，與對照組比較，實驗組小鼠角膜上皮厚度各個區域均增厚（均P＜0.05）。見圖2。

2.2 不同時間PM2.5混懸液滴眼對小鼠角膜不同區域全層厚度的影響

兩組不同時間各區域角膜全層厚度，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同組間不同區域角膜全層厚度比較，差異有統計學意義（FC2=8.312，FS5=9.785，FSN5=7.376，FN5=9.125，FIN5=7.963，FI5=8.742，FIT5=9.664，FT5=8.562，FST5=9.617，FS6=7.617，FSN6=6.641，FN6=7.543，FIN6=8.123，FI6=7.542，FIT6=6.532，FT6=8.655，FST6=8.724；PC2=0.017，PS5=0.022，PSN5=0.019，PN5=0.023，PIN5=0.018，PI5=0.027，PIT5=0.021，PT5=0.019，PST5=0.026，PS6=0.022，PSN6=0.015，PN6=0.019，PIN6=0.024，PI6=0.016，PIT6=0.018，PT6=0.025，PST6=0.023）；②不同時間的區域角膜全層厚度比較，差異有統計學意義（FC2=11.312，FS5=12.792，FSN5=11.387，FN5=10.512，FIN5=13.612，FI5=14.678，FIT5=12.153，FT5=13.322，FST5=12.652，FS6=11.631，FSN6=14.961，FN6=12.152，FIN6=14.715，FI6=11.123，FIT6=11.231，FT6=13.435，FST6=11.712；PC2=0.021，PS5=0.032，PSN5=0.031，PN5=0.034，PIN5=0.028，PI5=0.038，PIT5=0.041，PT5=0.035，PST5=0.026，PS6=0.041，PSN6=0.025，PN6=0.037，PIN6=0.033，PI6=6.036，PIT6=0.026，PT6=0.029，PST6=0.033）；③兩組的角膜全層厚度變化趨勢均有差異（FC2=6.431，FS5=7.734，FSN5=7.642，FN5=7.612，FIN5=6.532，FI5=5.175，FIT5=7.542，FT5=6.626，FST5=6.675，FS6=5.093，FSN6=6.516，FN6=7.647，FIN6=5.841，FI6=6.357，FIT6=6.741，FT6=5.273，FST6=5.859；PC2=0.037，PS5=0.015，PSN5=0.017，PN5=0.041，PIN5=0.015，PI5=0.024，PIT5=0.021，PT5=0.023，PST5=0.012，PS6=0.022，PSN6=0.025，PN6=0.028，PIN6=0.019，PI6=0.012，PIT6=0.018，PT6=0.013，PST6=0.022）。干預第1和4天兩組間區域角膜厚度比較差異無統計學意義（均P＞0.05），第7天起，與對照組比較，實驗組小鼠角膜全層下部厚度的C2、IT5、I5、IN5、IT6、I6及 IN6區域增厚（均P＜0.05）。第10和14天，與對照組比較，實驗組小鼠角膜全層厚度各個區域均增厚（均P＜0.05）。見圖3。

2.3 兩組不同時間整體角膜上皮厚度和角膜全層厚度比較

圖2 從第4天起，隨著干預時間延長，角膜上皮下方各區最先增厚，其他區域隨后增厚

兩組不同時間角膜上皮厚度和角膜全層厚度的各區域平均值，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同組間角膜上皮厚度和角膜全層厚度比較，差異有統計學意義（F上皮=19.89，F全層=8.43；P上皮=0.035，P全層=0.015）；②不同時間角膜上皮厚度和角膜全層厚度比較，差異有統計學意義（F上皮=29.162，F全層=11.424；P上皮=0.026，P全層=0.032）；③兩組的角膜上皮和角膜全層厚度變化趨勢均有差異（F上皮=8.321，F全層=6.543 ；P上皮=0.038，P全層=0.019）。見表1、2。

圖3 從第7天起，隨著干預時間延長，角膜全層厚度也變厚，且中央和下方各區最先增厚，隨后其他區域增厚

表1 兩組不同時間的角膜上皮厚度比較 （mm，±s）

表1 兩組不同時間的角膜上皮厚度比較 （mm，±s）

注：1）與實驗組比較，P ＜0.05；2）與實驗前比較，P ＜0.05

組別 實驗前 第1天 第4天 第7天 第10天 第14天對照組 66.06±7.18 66.65±7.71 67.35±8.24 68.15±9.641）2） 68.48±9.351）2） 68.45±9.711）2）實驗組 66.24±7.59 67.41±8.06 70.29±8.82 72.71±10.71 74.41±11.18 75.88±12.12

表2 兩組在不同時間角膜全層厚度比較 （mm，±s）

表2 兩組在不同時間角膜全層厚度比較 （mm，±s）

注：1）與實驗組比較，P ＜0.05；2）與實驗前比較，P ＜0.05

組別 實驗前 第1天 第4天 第7天 第10天 第14天對照組 209.71±13.53 210.41±14.47 209.71±13.41 209.53±14.651）2） 210.53±15.241）2） 209.29±14.351）2）實驗組 209.65±13.76 210.47±14.24 212.47±15.12 219.24±15.41 221.29±16.41 222.65±17.76

3 討論

近年來，OCTA已被成功地用于檢查有角膜病理特征患者的異常角膜新生血管[11]。OCTA是一種非侵入性成像技術，通過檢測相位變化或反射率變化以檢測血管內血液流動，還能同時獲得周圍組織的光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）影像[12]，因此應用OCTA可以檢測角膜上皮和角膜全層各區域厚度的改變。

角膜上皮位于角膜的最外層，容易受到各種損傷。研究表明，紫外線輻射和防腐劑等多種因素可以通過誘導DNA損傷從而損害角膜上皮[13]。PM2.5是復雜的化學和生物物質混合物，含有多環芳烴和離子等，該物質不僅吸附在PM2.5表面，還深入到其中心結構[14]，且在室內粉塵引起的毒性中起著至關重要的作用。PM2.5中還富含Pb、Al和MN等金屬，且PM2.5對人體的影響與該金屬對人體的影響相一致。眼表是直接與外部環境接觸的，因此外部環境的變化將會對眼部微小環境產生重大的影響。以前的研究表明，PM2.5可以在許多細胞類型中誘發DNA損傷。近年來有研究表明，PM2.5暴露可誘導角膜上皮細胞DNA損傷和細胞衰老，進而損害角膜上皮修復再生能力。γ-H2AX是H2A蛋白家族的一種變異體，是DNA損傷反應的重要調控器。其是由絲氨酸139在DNA損傷后的1～3 min在激酶的催化作用下磷酸化形成。γ-H2AX是DNA修復中重組和定位作用的第1個蛋白，因此，細胞中γ-H2AX含量增高可以間接反應細胞中DNA損傷從而修復活躍。有研究表明，利用免疫熒光技術檢測暴露在PM2.5后的角膜上皮細胞中γ-H2AX發現其含量上升，說明角膜上皮細胞暴露在PM2.5后影響其DNA損傷后的修復，從而誘發角膜上皮細胞衰老，衰老細胞通過分泌炎癥細胞因子和產生氧化應激作用對鄰近的細胞產生衰老效應[15]，使得損害范圍增大。角膜上皮干細胞也稱為角膜緣干細胞，是位于角膜緣基底上皮層的干細胞。許多研究表明，角膜上皮干細胞是角膜上皮細胞增殖的來源，對角膜上皮再生非常重要。因此，PM2.5導致角膜上皮再生不足，也可能是通過誘導角膜上皮干細胞衰老進而加重角膜上皮的損害。而且衰老的角膜經歷了結構的改變，更容易受到感染[16]，從而形成惡性循環。PM2.5影響角膜上皮細胞和角膜上皮干細胞DNA損傷機制可能通過誘導角膜上皮細胞產生活性氧進一步發生氧化應激作用而產生的[17]。活性氧是含氧的化學反應分子，是正常細胞代謝的副產物，其在病理生理條件下會增加，從而導致活性氧生成和細胞內防御機制失衡，即氧化應激作用。活性氧會損害細胞結構，許多研究表明，活性氧的形成是微粒物質在不同類型細胞中發揮毒性作用的一種關鍵機制[18]。而PM2.5可誘導角膜上皮細胞產生活性氧從而對自身產生損害[17]，抑制氧化應激作用可以有效地減緩這一損害。且該損害與PM2.5濃度有關。2013年TAU等[9]在研究中發現，當PM2.5濃度低至0.5 μg/ml時，角膜上皮細胞的存活時間也會降低，本研究中PM2.5濃度為5 mg/ml，對角膜上皮的影響為促進其厚度增加。還有研究表明，微粒對人體的影響與該微粒自身的直徑有關[19]，根據其大小，PM存放在于不同的呼吸道水平。通常情況下，大直徑的微粒通過鼻纖毛和黏液被過濾，直徑＞10 μm的微粒可以滲透到肺和支氣管肺泡結構。直徑＞2.5 μm的微粒有更大滲透能力。其可能滲透到正常的支氣管壁，且干擾肺的氣體交換[20]。該微粒最終會滲透到人的血管內，通過血液循環可能影響身體的其他部位[21]，使得PM2.5危害更大。該規律與PM2.5對角膜上皮細胞的影響一致，超細顆粒物（DEPs）指環境空氣中空氣動力學當量直徑≥0.1 μm的顆粒物，是PM2.5中的一種，與暴露在DEPs中的角膜上皮細胞比較，暴露在PM2.5中的角膜上皮細胞的細胞毒性更強[19]，這可能是由于顆粒直徑不同造成，PM2.5的直徑比DEPs要大，因此，PM2.5可能攜帶更多有害化學物質。

近年來，也有研究表明PM2.5可破壞淚膜穩定性，從而引起眼部的各種不適，即引起干眼綜合征（dry eye syndrome，DES）[22]，DES將會進一步造成角膜的嚴重損害（侵蝕和繼發感染等），甚至導致視力喪失[23]，干眼引起角膜上皮和角膜全層厚度增加，可能與其通過改變角膜上皮不同細胞密度和角膜結構有關。研究表明，干眼會引起角膜上皮中不同細胞的密度發生變化。可引起中央區角膜上皮細胞，包括表層鱗狀上皮細胞、翼狀上皮細胞和上皮基底層細胞的細胞密度下降[24]，但近年來關于干眼對角膜結構的影響仍有爭議，李晶等人使用高滲鹽水點眼制作小鼠干眼模型發現，實驗組小鼠的角膜上皮層基底部細胞缺失，分層減少，出現空洞，角膜上皮層厚度減少，這可能與PM2.5誘導角膜上皮細胞發生氧化應激反應觸發的自噬現象[25]有關。而FABIANI等[26]用人工氣候室制作小鼠干眼模型，發現干眼小鼠模型角膜上皮層厚度增加。李娟等[8]在研究中發現，干眼小鼠模型角膜上皮中翼狀細胞及基底細胞排列紊亂，細胞層數開始增多，上皮厚度增加。本研究發現實驗組小鼠角膜上皮和角膜全層厚度均隨干預時間增加而增加。角膜上皮下部各區域厚度首先增加，隨后其他區域厚度增加，角膜全層中央和下部各區域厚度首先增加，隨后其他區域厚度增加。且角膜全層增厚速度慢于角膜上皮增厚的速度，提示PM2.5導致的干眼可能引起角膜侵蝕性損害，引起角膜除上皮層外其他層的細胞損傷。而角膜上皮厚度和角膜全層厚度的各區域平均值變化和全層厚度變化是一致的，進一步證明PM2.5影響角膜的變化趨勢。

綜上所述，PM2.5能引起小鼠角膜上皮和角膜全層厚度增厚，且角膜上皮增厚的速度大于角膜全層增厚的速度，這可能與PM2.5引起角膜上皮細胞和角膜上皮干細胞的衰老反應，衰老細胞分泌炎癥細胞因子和產生氧化應激作用從而改變角膜上皮厚度有關，筆者將進一步研究其增厚的原因是否與其他因素有關，是否與角膜上皮不同細胞密度的改變或者角膜結構改變有關。本研究也為PM2.5導致的干眼影響角膜上皮厚度的現象提供依據。同時在其預防和治療上有一定意義。

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