抗生素在基因工程藥物生產(chǎn)中的應用

周偉 范杰 楊玉紅 夏煥章 闞國仕 徐艷 陳紅漫 王媛媛

摘要：基因工程藥物在目前醫(yī)藥市場所占的比例越來越大。在基因工程藥物生產(chǎn)的過程中，抗生素在某些環(huán)節(jié)起到了不可或缺的作用。本文就抗生素在基因工程藥物生產(chǎn)中的應用進行總結(jié)。

關(guān)鍵詞：抗生素；基因工程藥物；工程細胞

基金項目：2016年沈陽農(nóng)業(yè)大學教學項目“《生物技術(shù)制藥》跨校修讀學分課程教學模式的研究與實踐”（ 2016-189），“生物工程專業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育與學生綜合素質(zhì)提升的研究與實踐”（2016-161）；遼寧省教育廳“省級工程人才培養(yǎng)模式改革試點專業(yè)——生物工程”，GZ201340

中圖分類號： R915 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.04.046

自20世紀80年代以來，現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是分子克隆、基因重組以及生物工程和細胞大規(guī)模培養(yǎng)等關(guān)鍵技術(shù)的突飛猛進，已經(jīng)有越來越多的生物技術(shù)藥物進入臨床應用，成為防病、治病藥物的一個重要部分。當前生物技術(shù)藥物正趕超傳統(tǒng)化學制藥，逐漸成為現(xiàn)代醫(yī)學所依靠的重要藥物來源，是當今最活躍和發(fā)展最迅速的領(lǐng)域。據(jù)1998年美國藥學會統(tǒng)計，美國FDA已批準了56種生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品上市，其中絕大多數(shù)為基因工程藥物。此外，還有200多種基因工程藥物正在進行臨床試驗，其中至少有1/5的產(chǎn)品將可能在今后十年內(nèi)上市[1]。

基因工程藥物主要是指利用重組DNA技術(shù)，將生物體內(nèi)生理活性物質(zhì)的基因在細菌、酵母、動物細胞或轉(zhuǎn)基因動植物中大量表達生產(chǎn)的新型藥物。基因工程藥物生產(chǎn)的基本流程是：將目的基因用DNA重組的方法連接在載體上，然后將載體導入靶細胞（微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞），使目的基因在靶細胞中得到表達，最后將表達的目的蛋白質(zhì)提純及做成制劑，從而成為基因工程類藥物苗。在基因工程藥物研究和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)中，抗生素發(fā)揮了不可替代的作用。本文以基因工程藥物研發(fā)和生產(chǎn)的流程為線索，探討抗生素在基因工程藥物生產(chǎn)中的作用。

1 基因工程菌的構(gòu)建

1.1 宿主細胞的選擇和培養(yǎng)

基因工程中基因高效表達是指外源基因在某種細胞中的轉(zhuǎn)錄、翻譯、所有加工過程和表達活動。在外源基因表達的過程中宿主菌的選擇事關(guān)重要，根據(jù)國家藥典（2015版）規(guī)定，常用的宿主細胞主要由有兩大類，第一類為原核細胞（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）；第二類為真核細胞（酵母、絲狀真菌等）[2]。作為宿主，勿庸置疑會對外源基因的表達產(chǎn)生一定的影響。每一個宿主細胞都像一個微觀的小工廠，按照細胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務”。為了解決細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的污染問題，宿主細胞本身可以具有選擇標記，常用的方法如抗生素標記等。但需要注意的是，為了構(gòu)建工程菌株過程中的篩選過程，要求宿主細胞與載體所攜帶的抗性標種類不同，便于后期雙抗培養(yǎng)基的配置及陽性克隆的篩選[3]。

1.2 載體中抗性篩選標記

載體是指在基因工程重組DNA技術(shù)中將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子。基因工程中用于選擇的篩選標記一般在載體上，在基因工程意義上來說，它是重組DNA載體的重要標記，合適的篩選標記基因及其相應的篩選劑是轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵，供重組DNA的鑒定和選擇[4]。

標記基因種類多種多樣，主要包括抗性基因、顏色反應基因、代謝缺陷型互補基因和一些其他具有明顯性狀表型有關(guān)的基因。其中抗性基因，尤其抗生素標記基因（如抗卡那霉素基因、抗氨芐青霉素基因、抗新霉素基因），因抗生素分子更小、反應更靈敏的特點是目前最普遍使用的標記基因[5]。例如以基因克隆中普遍使用的載體pBR322為例，該載體含有兩種抗生素抗性基因作為選擇標記基因：氨芐青霉素抗性基因（AmpR）和四環(huán)素抗性基因（TetR），TetR基因內(nèi)部含有限制酶等酶切位點。將外源DNA分子和載體構(gòu)建為重組子，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞后，接種至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基。經(jīng)過培養(yǎng)，含有載體的大腸桿菌因具有抗氨芐青霉素的表型，在培養(yǎng)基上可形成菌落，而不含有載體的大腸桿菌則不能生長。

2 基因工程細胞（菌株）的發(fā)酵過程

目的基因經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導入受體細胞后，需經(jīng)過一系列篩選和擴增，獲得穩(wěn)定、高效表達的目的蛋白的工程細胞（菌）株。進行工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時，也是外源基因高效表達目的蛋白的過程。工程細胞（菌）株大規(guī)模培養(yǎng)的基本條件和優(yōu)化設計及控制中添加適當種類和濃度的抗生素對外源基因的高效表達至關(guān)重要。

2.1 培養(yǎng)工程細胞（菌株）的器皿消毒

細胞培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵之一是防止微生物的污染。這里除了操作者必須具有很強的無菌觀念、嚴格按照無菌規(guī)程進行操作之外，所有培養(yǎng)用的器材和液體都必須進行嚴格的消毒滅菌處理[5]。除了物理消毒法外，常常會用到抗生素對各種培養(yǎng)器皿進行消毒。常用到的抗生素包括青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等，但各種抗生素的用量差別很大。

2.2 工程細胞（菌株）發(fā)酵液中添加抗生素

在工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵工程細胞的過程中，往往會在發(fā)酵液中有目的地加入抗生素，其原因如下：

保證基因工程菌的穩(wěn)定性：基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。在提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法中的選擇壓力法，就是在培養(yǎng)基中加入抗生素，它也是工程菌培養(yǎng)中提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的常用方法[6]。含有抗藥性基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞，基因工程菌就獲得了抗藥性。發(fā)酵時在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素可以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，消除重組質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的影響，從而提高發(fā)酵生產(chǎn)率。

協(xié)助形成細胞壁缺陷：在培養(yǎng)基中加入青霉素、甘氨酸或絲裂霉素 C 等因子，便可破壞或抑制細胞壁中肽聚糖的結(jié)構(gòu)或其合成受到抑制，但還不至于造成細菌死亡，細胞壁有缺陷的細胞，對滲透壓敏感，容易破裂，為胞內(nèi)代謝目的產(chǎn)物的分離純化提供了便利條件。

防止培養(yǎng)過程中出現(xiàn)其他雜菌污染：抗生素可以通過影響雜菌細胞壁合成（青霉素類和頭孢菌素類）、影響雜菌細胞膜滲透性（多粘菌素和短桿菌素）、干擾蛋白質(zhì)的合成（福霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素）、抑制核酸的轉(zhuǎn)錄（萘啶酸和二氯基吖啶）等方式抑制雜菌的出現(xiàn)。需要注意的是，在某些生產(chǎn)過程中即使存在雜菌污染，也不需要添加抗生素。因為當微生物制藥過程中微生物的數(shù)量的增加及代謝物的積累，形成的環(huán)境已經(jīng)不再適合其他微生物的生長，會主動抑制雜菌。

3 合理使用抗生素

過度使用抗生素的危害是多方面的，對細菌來說，會產(chǎn)生耐藥性，也就是說過多的使用抗生素會使細菌對其產(chǎn)生抵抗力，從而使抗生素的抗菌作用減弱或消失[7]。抗生素使用過多是否對我們所需要的藥物有一定影響？對基因工程藥物的合成、制備和分離是否有影響？以上問題都是未知的。除此之外，抗生素引發(fā)的毒性反應更不可忽視，因此，在基因工程藥物生產(chǎn)過程中合理利用抗生素，規(guī)避使用抗生素帶來的一些問題，也是我們將來的研究方向。

參考文獻

[1]郭行彥.基因工程藥物的分離與純化方法[J].國外醫(yī)學：抗生素分冊，1994（07）：261-267.

[2]國家藥典委員會.中國人民共和國藥典[M].北京：化學工業(yè)出版社，2015.

[3]匡光偉，孫志良，陳小軍，等.四環(huán)素類抗菌藥物的降解研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26（05）：1744-1788.

[4]朱保泉，生物制藥技術(shù)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2004：46-102.

[5]夏煥章，熊宗貴，等.生物技術(shù)制藥[M].高等教育出版社，2006：140-162.

[6]陳兆坤，胡昌勤，等.頭抱菌素類抗生素的降解機制[J].國外醫(yī)藥：抗生素分冊，2004，25（06）：219-265.

[7]崔浩.抗生素的細菌耐藥性：酶降解和修飾[J].國外醫(yī)藥：藥學分冊，2006，33（01）：34-36.

作者簡介：周偉，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)制藥。

通訊作者：王媛媛，博士，講師，研究方向：生物工程的教學和科研。