Eph受體酪氨酸激酶A2和金屬蛋白酶2在大腸癌組織的表達及其與大腸癌發生發展的關系

高其宏

(蕪湖市第二人民醫院胃腸外科，安徽 蕪湖 241000)

大腸癌在臨床上是一種常見的腸道惡性腫瘤，且近年來發病率有著逐漸增高的趨勢。手術切除和術后的放、化療及綜合免疫治療等，是大腸癌當前最主流的也是最有效的治療方法。對于早期大腸癌手術切除后，治療效果明顯，生存期明顯延長，但對于中晚期大腸癌術后出現轉移及復發的概率明顯增加。腫瘤轉移的途徑主要有淋巴結轉移，血運轉移及局部侵襲、浸潤轉移等[1]。Eph受體酪氨酸激酶A2(erythropoietin-produceing hepatocellular A2，EphA2)是促進新生血管形成最主要的因子，在腫瘤發生發展中起著重要的促進作用[2]。而金屬蛋白酶-2(MMP-2)作為金屬蛋白酶(MMPs)家族重要成員之一，本身是一種明膠酶，它的主要作用就是破腫瘤細胞周圍的基質和基膜，從而使腫瘤細胞能夠更容易的進行侵襲和轉移[3]。關于EphA2和MMP-2在大腸癌的發生發展中到底扮演何種角色，研究的不甚清楚。本文通過免疫組織化學法聯合檢測EphA2蛋白和MMP-2蛋白在大腸癌及癌旁組織中的表達，探討其在大腸癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1．1 標本及分組

(1)大腸癌組織：選取蕪湖市第二人民醫院2011年1月—2016年12月大腸癌手術切除后石蠟包埋標本76例，其中男性患者44例，女性患者32例，年齡區間為34～82歲，中位年齡57．6歲。且要求所有患者術前均未接受對于腫瘤的針對性治療。其中高分化(包括高級別上皮類瘤變)癌3例，中分化癌45例，低分化(包括黏液腺癌、印戒細胞癌)癌28例。有無淋巴結轉移51/25例。

(2)癌旁組織：在相應的76例大腸癌標本中，取距腫瘤3 cm以上病理檢查未受到腫瘤侵犯的大腸組織。

1．2 試劑

MMP-2為鼠抗人單克隆抗體，EphA2為兔抗人多克隆抗體，兩者均購自北京中杉金橋生物工程有限公司；枸櫞酸緩沖液及DAB顯色劑均購自福州邁新生物制劑有限公司；雙氧水、微波爐等均來自本院病理科。

1．3 試驗方法

將選中蠟塊按4 mm間距連續切片，切片常規進行HE染色和免疫組化染色，光鏡下觀察。免疫組織化學法主要分為幾步：(1)雙氧水行內源酶滅活，(2)抗原修復液修復抗原，(3)滴加一抗，(4)滴加二抗，(5)滴加鏈霉素抗生物素過氧化物酶，(6) DAB顯色，(7)蘇木素復染，(8)脫水/透明/封片，顯微鏡觀察。

1．4 結果判斷

EphA2和MMP-2蛋白免疫組化陽性表達均是在細胞質內出現棕黃色染色。用半定積分法(即染色強度得分與陽性細胞百分率得分之和)判斷兩者表達強度。染色強度的評分標準：胞質未著色為0分，著淡黃色為1分，中等黃色為2分，深黃及褐色為3分。陽性細胞百分率的評判標準：隨機選取5個不重復高倍鏡視野，通過計算每個視野100個細胞中陽性細胞所占比例，得出此切片的平均陽性細胞百分率。平均陽性細胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～49%為2分，>49%為3分。兩項得分之和，0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)，2～6分均表示為陽性。

1．5 統計學方法

應用SPSS21．0統計軟件分析包近代數據分析。觀測數據主要為計數資料，其中部分為等級數據，其它均為兩分類數據，故組間比較統一采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 EphA2和MMP-2在大腸癌、癌旁組織中的表達情況

大腸癌組織中EphA2蛋白表達陽性率為92.10%(70/76)，顯著高于癌旁組織26．31%(20/76)、(P<0.05)。其中，EphA2中度陽性表達率和強陽性表達率分別為27.63%(21/76)及25%(19/76)，均顯著高于癌旁組織的表達率(7.89%)、(5.26%)，見圖1、圖2。MMP-2在大腸癌組織中陽性表達率為80.20%(61/76)，同樣顯著高于癌旁組織15．90%(12/76)，(P<0.05)；其中大腸癌組織中中度陽性表達率和強陽性表達率分別為13.16%(10/76)、25%(19/76)，均顯著高于癌旁組織的中度陽性及強陽性表達率(2.6%，2.6%)，見圖3、圖4。

2．2 EphA2與MMP-2的表達與臨床病理特征的關系

大腸癌組織中的EphA2蛋白的表達強度較高，且EphA2蛋白表達水平與大腸癌組織分化程度、Dukes分期、淋巴結轉移、年齡多有密切關聯(部分比較為P<0.05)；MMP-2蛋白在大腸癌組織中同樣呈高表達，其表達情況與大腸癌組織學分化程度、Dukes分期、淋巴結轉移、年齡也有較密切的關聯(部分比較為P<0.05)，見表1、表2。

3 討論

腫瘤組織發生、發展有賴于新生血管的形成為其提供營養，EphA2是Eph家族中EphA亞家族的一個成員，是促進新生血管形成最主要的因子之一。有研究顯示EphA2通過血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)模式，促進腫瘤毛細血管網不斷壯大，從而參與腫瘤的生長過程[4]。有研究顯示組織中EphA2表達程度與毛細血管的形成呈正相關，而腫瘤組織只要大于1 mm就會有毛細血管形成，因此EphA2在很多實體腫瘤中呈高表達狀態。

表1 兩種組織中EphA2和MMP-2的表達情況及比較/例

表2 大腸癌中EphA2和MMP-2的表達與各臨床病理特征之間的關系/例

有觀點認為EphA2調節血管生成的機制主要是通過與其配體EphrinA1的結合影響腫瘤血管內皮細胞的遷移，并通過影響細胞骨架，基質黏附和細胞黏附。從而促進組織和內皮細胞形成毛細血管樣結構的形成、調控血管生成[5]。由此可見EphA2主要是通過促進腫瘤新生血管形成來參與惡性腫瘤的發生發展。局部浸潤及淋巴轉移、血性轉移是惡性腫瘤復發及遠處轉移的主要方式，它們直接影響著患者的預后，而腫瘤新生血管的形成直接參與了上述三大過程，因此必然是腫瘤發生、發展的重要一環[6]。本研究表明，EphA2蛋白在大腸癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織 (P<0.001)，且與大腸癌的Dukes分期明顯相關(P<0.05)，依此結果推斷EphA2可能在Dukes分期較晚的腸癌患者中促進了大腸癌新生血管的形成，進而導致了大腸癌的發展，并且影響大腸癌出現淋巴結轉移。

MMPs是一個含有9種酶蛋白分子的家族，它們主要通過破壞腫瘤組織周圍細胞基質和基底膜，從而使腫瘤細胞進行更加容易的在局部進行浸潤轉移[7]。細胞基質和基底膜的主要構成蛋白則是Ⅳ型膠原和層黏連蛋白，而MMP-2本身是一種明膠酶，它是降解Ⅳ型膠原三螺旋結構的主要蛋白酶，因此它可能就腫瘤局部浸潤的始動因素[8]。近年來不斷有研究顯示MMP-2在一些腫瘤的局部浸潤轉移中發揮著相當重要的作用[9]。本研究表明，大腸癌中MMP-2的表達水平明顯高于癌旁組織(P<0．001)。且與大腸癌組織學分化程度、淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)。依此結果推斷MMP-2可能在組織分化程度不佳的病人中參與了大腸癌的侵襲、浸潤，并較早較快的出現淋巴結轉移，最終導致了大腸癌Dukes分期變晚，預后變差。

EphA2及MMP-2在大腸癌的發生發展中均可能起到了積極地促進作用，因此在臨床上我們可以考慮通過聯合檢測EphA2、 MMP-2表達水平來判斷大腸癌的惡性程度，以及預判患者的預后情況。另外我們也可以通過研究EphA2和MMP-2的作用機制，使它們成為靶向治療的新方向。另外兩者之間是否存在相互促進的因素，從而加快了大腸癌的進程，它們是否還有其它的作用機制未被我們發現，值得我們去進一步研究。

(本文圖1～4見插圖5-2)

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