高水解率低乳糖奶的制備及糖類分析

伍桃英

程云輝1

趙良忠2

歐陽林3

許 宙1

(1.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410076；2.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；3.邵陽學院第二附屬醫院普外科，湖南 邵陽 422000)

牛乳富含蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質以及多種維生素，是自然界賜予人類最理想的天然食品之一[1]。乳糖是乳類中特有的碳水化合物，牛乳中乳糖含量為4.6%～5.0%，占總糖量的99%以上[2]。正常生理條件下，乳糖經小腸內乳糖酶作用，水解為葡萄糖和半乳糖才能被人體吸收，但是當人體內乳糖酶缺乏或活力不夠時，攝入含乳糖的乳制品易發生乳糖吸收不良甚至乳糖不耐癥，這是制約乳及乳制品消費的主要原因之一[3]。β-半乳糖苷酶能將牛乳中的乳糖水解成葡萄糖、半乳糖[4]。目前酶法水解乳糖制備低乳糖奶的方法有2種：① 采用低溫長時水解法，即在線添加乳糖酶后，采用4～6 ℃水解12～20 h；② 采用高溫短時水解法，即采用中高溫酶，在30～40 ℃水解2～4 h。馬夫俠[5]、秦立虎[6]、常忠義[7]、王輝[8]等采用這2種方法對低乳糖奶的制備進行了研究，但其乳糖水解率大多在60%～70%，只能一定程度上緩解乳糖不耐受癥狀。因此，采用β-半乳糖苷酶制備高水解率低乳糖奶，對滿足乳糖不耐癥患者的消費需求及促進中國乳品工業的發展仍具有十分重要的意義。本研究擬以乳糖水解率為考察指標，利用游離的β-半乳糖苷酶對牛乳中的乳糖進行水解，通過響應面優化，確定高水解率低乳糖奶水解的最佳工藝，并采用HPLC對低乳糖乳奶中的糖類進行分析，以期為高水解率低乳糖奶工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉：湖南亞華乳業有限公司；

Lactozyme：3 000 U/mL，諾維信(中國)生物技術有限公司；

Maxilact：3 000 U/mL，帝斯曼食品配料公司；

K3-T：5 000 U/g，山東天賜國際貿易有限公司；

Lactose F：300 U/g，日本天野酶制品株式會社；

葡萄糖試劑盒：上海科欣技術研究所；

葡萄糖、半乳糖、乳糖：色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

試驗用水為實驗室自制蒸餾水。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters600型，沃特世科技(上海)有限公司；

可見分光光度計：SpectrumLab 22PC型，上海棱光技術有限公司；

臺式pH計：Delta320型，上海君達儀器儀表有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，上海精密科學儀器有限公司；

可調式移液槍(20～200 μL)：Finnpipette型，熱電(上海)儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：CS202型，重慶實驗設備廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 低乳糖奶的制備工藝

1.3.2 操作要點

(1) 配制復原乳：由于牛奶中乳糖含量為4.6%～5.0%，此次研究采用全脂奶粉按照1∶7 (g/mL)的復水比配制成復原乳，乳糖及其水解率的測定采用碘量法[9]，按式(1)計算乳糖水解率。

(1)

式中：

α——乳糖水解率，%；

c0——單質碘標準溶液的濃度，mol/L；

V0——測定時準確移取的單質碘的體積，mL；

cs——Na2S2O3溶液的濃度，mol/L；

V1、V2——酶解前、后牛奶濾液消耗Na2S2O3的體積，mL。

(2) 酶活測定：采用葡萄糖氧化酶試劑盒法[10]。

(3) 乳糖水解：復原乳經95 ℃/15 s殺菌后冷卻到適宜溫度，以一定比例添加乳糖酶，于恒溫水浴振蕩器中水解一定時間。

1.3.3 HPLC法檢測牛奶中的糖類 采用高效液相色譜儀對牛奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖及低聚半乳糖進行定量檢測，樣品經12 000 r/min離心后直接檢測，具體的HPLC條件[11]：

(1) 檢測葡萄糖、半乳糖的HPLC條件：Sugar-Pak I(6.5 mm×300 mm)色譜柱；流動相：純水；檢測器靈敏度：4；柱溫：85 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL。

(2) 檢測乳糖、低聚半乳糖的HPLC條件：Hpersil APS(4.6 mm×250 mm)色譜柱；流動相：乙腈/水(75/25)；檢測器靈敏度：4；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖及低聚半乳糖分別按式(2)～(5)計算：

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：

c1、c2、c3、c4——樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的濃度，mg/mL；

c10、c20、c30、c40——標樣中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的濃度，mg/mL；

S1、S2、S3、S4——樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的峰面積，mV·min；

S10、S20、S30、S40——葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖標樣的峰面積，mV·min。

2 結果與討論

2.1 制備低乳糖奶的工藝研究

β-半乳糖苷酶的酶活采用葡萄糖氧化試劑盒測定，酶活見表1。

Lactase F乳糖酶為酸性乳糖酶，在中性的鮮乳或復原乳中酶活不高；Lactozyme、Maxilact、K3-T均為中性乳糖酶，其中Lactozyme、K3-T在40，45 ℃酶活較高且活性相當，適用于牛乳中乳糖的分解，但K3-T較 Lactozyme價格高昂，因此，綜合選擇酶活較高、價格較低的Lactozyme乳糖酶作為制備低乳糖奶的游離酶種。在單因素試驗的基礎上，以[E]/[S]、水解溫度及時間為因素，以乳糖水解率為響應值，采用響應面法[12-14](RSA)尋求酶解最優工藝參數，RSA試驗設計與結果分別見表2、3。

表1 4種β-半乳糖苷酶的酶活Table 1 The enzyme activities and prices of three kinds of β-galactosidase

表2 RSA試驗因素水平Table 2 Experimental factors and levels of RSA

表3 RSA試驗結果Table 3 Experimental results of RSA

采用Design Expert 8.0.5B軟件對RSA試驗結果進行二次回歸分析，得到方程：

α=84.89+3.98A-0.80B+4.50C+0.12AB+1.95AC+0.82BC-2.78A2-11.79B2-1.08C2。

(6)

為了進一步研究相關變量之間的交互作用并確定最優點，通過Design-Expert繪制響應面曲線圖進行可視化分析，以水解率(α)作為響應值，分別作水解溫度與水解時間、[E]/[S]與水解溫度、[E]/[S]與水解時間關系圖，結果見圖1～3。

圖1反映了在[E]/[S]為1.25‰時，水解溫度與時間對乳糖水解率影響的響應面曲線。由圖1可知，同一溫度下，乳糖水解率隨著水解時間的增加而增大；相同[E]/[S]與水解時間下，乳糖水解率與水解溫度呈拋物線變化。當[E]/[S] 為1.25‰、水解溫度為37.5～40.0 ℃、水解時間為3.0 h時，乳糖水解率最高可達90.65%。

圖2反映了在水解時間為2.5 h的條件下，[E]/[S]和水解溫度對乳糖水解率的影響。由圖2可知，隨著[E]/[S]的提高，乳糖水解率隨之增大；同一[E]/[S]條件下，乳糖水解率與溫度呈拋物線變化趨勢。當[E]/[S]為1.5‰、水解溫度為37.5～40.0 ℃時，乳糖水解率可達89.13%。

表4 RSA 方差分析?Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

圖1 水解溫度與時間對乳糖水解率影響的響應面與等高線圖([E]/[S]=1.25‰)
Figure 1 Response surface and contour plots surface of the effects of hydrolysis temperature and time on the hydrolysis rate of lactose

圖2 [E]/[S]與水解溫度對乳糖水解率影響的響應面與等高線圖(水解時間2.5 h)Figure 2 Response surface and contour plots surface of the effects of [E]/[S] and Hydrolysis Temperature on the hydrolysis rate of lactose

圖3 [E]/[S]與水解時間對乳糖水解率影響的響應面與等高線圖(水解溫度40 ℃)Figure 3 Response surface and contour plots surface of the effects of [E]/[S] and hydrolysis time on the hydrolysis rate of lactose

圖3反映了在水解溫度為40 ℃條件下，[E]/[S]與水解時間對乳糖水解率的影響。由圖3可知，同一溫度下，水解相同時間，乳糖水解率隨著[E]/[S]的增加而增大；同一[E]/[S]條件下，乳糖水解率與水解時間呈正相關。當[E]/[S] 為1.5‰、水解時間為3.0 h時，乳糖水解率最高可達91.04%。

通過Design Expert軟件分析，得出水解牛乳中乳糖的最佳工藝條件為：[E]/[S]為1.50‰、水解溫度38.06 ℃、水解時間3.0 h。在此條件下3組平行驗證實驗的平均得率為92.67%，與軟件估測值93.55%相近，說明實際情況與優化結果能良好吻合。

2.2 HPLC法分析乳中的糖類

低乳糖奶采用RSA得到的最佳工藝制備，復原乳與低乳糖奶樣品于95 ℃殺菌5 min，冷卻后12 000 r/min離心，用HPLC直接檢測。

2.2.1 樣品中乳糖、葡萄糖、半乳糖 在檢測葡萄糖、半乳糖的HPLC條件下，首先對乳糖(RT)、葡萄糖(PTT)、半乳糖(BRT)3個標樣進行檢測，得到的色譜圖見圖4，各個標樣對應的保留時間、峰面積與濃度數值見表5。復原乳與低乳糖奶中乳糖、葡萄糖、半乳糖的HPLC圖見圖5、6。

圖4 標樣的色譜圖Figure 4 Chromatogram of standard samples

表5 標樣的檢測結果Table 5 The test results of standard samples

圖5 復原乳中糖類的HPLC圖Figure 5 The HPLC diagrams of various sugars in milk

圖6 低乳糖奶中糖類的HPLC圖Figure 6 The HPLC diagrams of various sugars in low-lactose milk

由圖5、6可知，復原乳中的糖類主要是乳糖，含量為52.343 mg/mL，不含葡萄糖，半乳糖的含量極微，濃度為0.626 mg/mL；而低乳糖奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖的含量分別為6.086，9.964，26.101 mg/mL，說明復原乳中近90%的乳糖被β-半乳糖苷酶水解，生成了葡萄糖、半乳糖；但乳糖、葡萄糖、半乳糖的總和小于100%，說明還有其他糖生成。

2.2.2 樣品中乳糖、低聚半乳糖 由于乳糖在水解過程中除生成葡萄糖、半乳糖之外，還生成了其他糖，在此對低聚半乳糖進行研究。在檢測乳糖、低聚半乳糖的HPLC條件下對低聚半乳糖對照品標樣進行檢測，結果見圖7和表6。

由圖8、9可知，復原乳中93.05%的糖是乳糖，通過HPLC還檢測出了另外3種糖，其含量合計為整個糖類的6.95%；而低乳糖奶中的乳糖、低聚半乳糖的含量分別為整個糖類的3.04%和14.02%，其余為單糖。說明β-半乳糖苷酶有轉糖苷的作用，可生成功能性低聚糖。

圖7 低聚半乳糖對照品標樣的色譜圖Figure 7 Chromatogram of galacto-oligosaccharide reference standard samples

表6 低聚半乳糖對照品標樣的檢測結果?Table 6 Results of galacto-oligosaccharide reference standard samples

? 對照品中保留時間6.325 min的峰為乳糖，保留時間為5.948，6.737 min及以后出峰的為低聚半乳糖組分的峰。

圖8 復原乳中糖類的HPLC圖Figure 8 The HPLC diagrams of various sugars inreconstituted milk

圖9 低乳糖奶中糖類的HPLC圖Figure 9 The HPLC diagrams of various sugars in low lactose milk

3 結論

本試驗采用Lactozyme制備高水解率低乳糖奶，通過響應面確定最佳條件為：[E]/[S] 1.50‰、水解溫度38.06 ℃、水解時間3.0 h，在此條件下制備的低乳糖奶的乳糖水解率高達92.67%，較前人[15]研究的乳糖水解率提高了20%～30%；通過HPLC分析，證明了復原乳中90%以上的乳糖被β-半乳糖苷酶水解，同時在自制的低乳糖奶中有14.02%的低聚半乳糖生成，說明了β-半乳糖苷酶既能水解乳糖，又有轉糖苷的作用。

本試驗在乳糖水解中生成了大量的還原性單糖，其羰基與蛋白質在滅菌過程中會發生美拉德反應，導致低乳糖奶產生非酶褐變，故需對低乳糖奶的褐變及其抑制進行后續研究。

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