早期乳腺癌患者循環腫瘤細胞TP53、磷脂酰肌醇-3激酶基因突變分析及其與患者臨床病理特征的相關性

林 健， 賈淞淋， 方 敏， 吳雅妮， 劉超乾， 蘇東瑋， 于 躍， 李恒宇， 盛 湲

海軍軍醫大學附屬長海醫院甲狀腺乳腺外科，上海 200433

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，晚期預后較差。因此早期監測腫瘤負荷對評判治療效果和預防疾病進展非常重要[1]。Cristofanilli等[2]采用CellSearch法對外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)進行篩選計數，證實CTC是轉移性乳腺癌進展和患者生存的獨立預后因素，CTC數量升高(>5個/7.5 mL)與預后不良及乳腺癌進展密切相關。腫瘤患者體內來自腫瘤細胞的DNA會持續釋放入血或其他體液形成循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，是反映轉移性乳腺癌治療反應特異性和敏感性最高的生物學指標[1]。ctDNA包含腫瘤特異性的基因突變，可作為一種特異性的基因標志或生物標志物[3]。

乳腺癌最常見的突變基因是TP53和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)。抑癌基因TP53突變與多種人類腫瘤發生和發展密切相關[4]。乳腺癌患者TP53的突變率為20%～50%[5]，TP53常見的突變位點有p.R175H、p.R248Q和p.R273H等，這些突變常導致下游基因的激活功能丟失[6]，基因組穩定性降低[7]。PI3K信號通路異常激活與乳腺癌的發生和發展密切相關。約25%的乳腺癌中發現PI3K突變，其常見突變位點是PI3KCA基因編碼螺旋形區域的p.E545K和p.E542K位點及編碼激酶區域的p.H1047R位點。這些突變會導致下游信號增強，促腫瘤發生和發展[8]。TP53和PI3K基因不同位點的突變與腫瘤不同的發生、發展和預后相關[9-10]。因此，TP53/PI3K突變檢測常被用于各類腫瘤治療管理[8, 11-12]。

Dawson等[1]發現轉移性乳腺癌中ctDNA TP53、PI3K突變位點的檢測能更敏感、更早期地預測乳腺癌的治療反應和疾病進展情況。因此，本研究選擇TP53基因的p.R248Q、p.R273H、p.R175H位點及PI3K基因的p.E545K、p.H1047R位點進行檢測。已有研究[13-15]采用檢測尿液ctDNA特定基因突變診斷列腺癌或膀胱癌甚至監測非小細胞肺癌，但尚無利用尿液來監測早期乳腺癌的報道。因此，本研究嘗試采用尿液作為檢測標本來源。

為了進一步探討TP53、PI3K突變在早期乳腺癌中的作用，本研究收集了患者的血液和尿液標本，采用CellSearch法采集血中CTC并檢測其數目，并采用微滴式數字PCR(ddPCR)技術檢測患者血、CTC及尿標本中TP53(p.R248Q)、TP53(p.R273H)、TP53(p.R175H)、PI3K(p.E545K)和PI3K(p.H1047R)共5種基因位點的突變情況，同時收集所有患者的臨床資料，分析基因突變和臨床病理特征間的相關性，探討CTC TP53/PIK基因突變檢測對乳腺癌診療和預后的判斷作用，以期在早期乳腺癌防治上尋找更有價值的生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月—2月海軍軍醫大學附屬長海醫院收治的女性乳腺癌患者和良性腫瘤患者共30例。納入標準：(1)無其他腫瘤病史；(2)術前未進行過任何抗腫瘤治療；(3)病理證實為乳腺癌或乳腺良性腫瘤；(4)術前檢查無轉移相關證據；(5)無其他嚴重系統性疾病或感染。其中26例乳腺癌初診患者接受手術治療；3例良性乳腺腫瘤患者接受腫塊切除；1例患者入院前已接受過乳腺腫塊切除手術，其免疫組織化學檢測結果未攜帶，因此未被納入本研究。

所有患者發病年齡為30～79歲，平均(54.2±12.8)歲；其中26例乳腺癌患者平均年齡為(54.6±13.1)歲。26例乳腺癌患者按分子分型：Luminal A型3例(11.5%)，Luminal B型14例(53.9%)，HER-2陽性型7例(26.9%)，三陰性2例(7.7%)；根據臨床分期：最多的是ⅡA期9例(34.6%)，其余分別為0期3例(11.5%)，ⅠA期4例(15.4%)，ⅡB期2例(7.7%)，ⅢA期4例(15.4%)，ⅢC期4例(15.4%)；按病理類型：浸潤性導管癌19例(73.1%)，導管原位癌3例(11.5%)，非特殊性浸潤癌2例(7.7%)，多形性癌1例(3.8%)，髓樣特征的浸潤性癌1例(3.8%)。3例良性腫瘤患者均為乳腺纖維腺瘤。

所有患者的臨床信息均從醫院電子病歷管理系統中提取，本研究經醫院倫理委員會審核批準。參與研究的患者均簽署了正式的知情同意文件。

1.2 病理學檢查 乳腺癌的組織類型、組織分級、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、HER-2和Ki-67水平等均來自患者的病理報告，其中ER、PR、HER-2和Ki-67指數等來自免疫組織化學染色結果。HER-2表達是免疫組織化學檢測和(或)熒光原位雜交(FISH)結果。HER-2陽性是指免疫組織化學檢測結果為和(或)FISH結果>2.2；HER-2陰性是指免疫組織化學檢測結果為0～+和(或)FISH<1.8[5]。

1.3 CTC計數 術前抽取7.5 mL靜脈全血于含EDTA抗凝及細胞防腐劑的CellSave管中，室溫保存，72 h內。采用CellSearch系統(Veridex)分離和計數CTC。采用CellSearch Epithelial Cell Kit處理標本，結果用CellSpitter Analyzer分析。熒光染色特性為EpCAM(+)、CK(+)、DAPI(+)和CD45(-)的細胞即為CTC[16]。

1.4 血漿、尿液的收集及DNA抽提 術前使用BCT管抽取至少10 mL全血，并留取20 mL尿液。血標本抽取后，3 h內分別以1 600×g和16 000×g，4℃，離心10 min，去除血細胞，每2～4 mL上清液分裝到50 mL離心管中，-80℃凍存；然后根據操作手冊，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(德國Qiagen公司產品)抽提血漿中ctDNA。尿液、CTC的DNA抽提參考既往文獻[13,17]進行。

1.5 基因突變檢測 按照QX200TM微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)系統(美國Bio-Rad公司產品)操作說明進行基因突變檢測。ddPCR反應體系共20 μL，包括10 μL 2×ddPCR SuperMix、5 μL DNA模板、2 μL引物 mix和3 μL去離子水。將20 μL反應體系依次加入96孔板，隨后加入70 μL微滴發生油，在自動微滴發生器中生成微滴。微滴生成結束后，將96孔板放入熱封儀中封鋁膜，隨后放入PCR擴增儀進行PCR擴增。PCR反應程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 1 min，40個循環；最后98℃ 10 min。擴增結束后采用QX200 Droplet Reader軟件進行分析，并用QuantaSoft分析軟件計算突變等位基因濃度(copies/μL，CMUT)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息參考以往文獻[11,18-19]報道。

2 結 果

2.1 CTC計數 共30例女性乳腺癌或良性腫瘤患者接受了CTC篩查和血、尿TP53/PI3K基因檢測，其中1例乳腺癌患者因就診前已在外院接受乳腺腫塊切除術而缺乏免疫組織化學檢測結果，因此被排除出研究。納入研究的29例患者中，良性腫瘤患者3例，均未檢測到CTC；乳腺癌患者26例，其中6例(23.1%)未檢測到CTC，20例(76.9%)檢測到CTC，CTC>5個者4例(15.4%)，CTC數值范圍為0～12，平均數為2.846±3.133，中位數為2。按臨床分期，除ⅢC期患者外，其余均檢測到CTC；其中，ⅠA和ⅢA期患者全部檢測到CTC，ⅡB期患者檢測到CTC較多，平均數目為4。按分子分型，Luminal A和三陰性乳腺癌全部檢測到CTC；其中CTC檢測數目最高的為三陰性乳腺癌，平均CTC檢測數為4。>40歲的患者CTC檢出率較高(P=0.028)。CTC與患者其他臨床病理特征的相關性無統計學意義。

2.2 TP53、PI3K基因突變

2.2.1 總體突變情況 29例患者血、CTC和尿標本，共獲得435個基因檢測結果，5種檢測的基因位點總共有82個發生突變(18.9%)。各基因突變率不同，最高的是TP53(p.R175H)，有29個(6.7%)突變結果；TP53(p.R248Q)、TP53(p.R273H)和PI3K(p.H1047R)分別有25(5.7%)、23(5.3%)和4(0.9%)個突變結果；最低為PI3K(p.E545K)，僅1個(0.2%)發生突變。5種基因位點間突變率差異有統計學意義(χ2=50.133，P<0.001)。

2.2.2 三類標本總體基因突變情況 血、CTC和尿三類標本中檢測到5種基因突變分別為29個(6.7%)、21個(4.8%)和3個(7.4%)，突變率差異無統計學意義(χ2=2.915，P=0.233)。

2.2.3 良惡性腫瘤5種基因突變情況 結果顯示每類標本的每種基因突變在良惡性腫瘤間突變構成情況無差異。82個基因突變結果中，乳腺癌的TP53 (p.R248Q、p.R273H、p.R175H)及PI3K (p.E545K、p.H1047R)突變數分別為22、21、28、1、3個，良性腫瘤的這5種基因突變數分別為3、2、1、0、1，統計分析顯示在良惡性腫瘤間5種基因突變構成差異無統計學意義(P=0.359)。

2.2.4 三類標本中5種基因突變情況 血、CTC、尿三類標本中5種基因突變分布情況差異有統計學意義(χ2=50.133，P<0.001)。其中，29份CTC標本中，突變率最高的是TP53(p.R175H)，有7份(24.1%)發生突變；TP53(p.R248Q)和TP53(p.R273H)均有6份發生突變(20.7%)，PI3K(p.H1047R)有2份(6.9%)，PI3K(p.E545K)無突變；5種基因突變率差異有統計學意義(P=0.007)。29份血標本中，突變率最高的是TP53(p.R175H)，有11份(37.9%)發生突變；TP53(p.R248Q)和TP53(p.R273H)分別有10份(34.5%)和8份(27.6%)發生突變，PI3K(p.E545K)和PI3K(p.H1047R)均無突變；5種基因突變率差異有統計學意義(χ2=25.172，P<0.001)。29份尿標本中，突變率最高的是TP53(p.R175H)，有11份發生突變(37.9%)；TP53(p.R248Q)和TP53(p.R273H)均有9份(31.0%)發生突變，PI3K(p.H1047R)有2份(6.9%)發生突變；最低的是PI3K(p.E545K)，僅1份(3.4%)發生突變；5種基因突變率差異有統計學意義(χ2=16.681，P=0.002)。

2.3 TP53、PI3K突變與乳腺癌臨床病理特征的相關性 結果(表1)表明：乳腺癌分子分型和Ki-67指數與CTC中TP53(p.R248Q)突變相關(Fisher Exact Test=10.839，P=0.003；P=0.028)，其中Luminal A型和Ki-67指數小于20%的乳腺癌TP53(p.R248Q)突變率較高，提示在治療Luminal A型乳腺癌時需要考慮TP53(p.R248Q)基因突變帶來的內分泌藥物抵抗等因素；腋窩淋巴結轉移可能與CTC標本中TP53(p.R175H)基因突變有關(P=0.058)，其中發生淋巴結轉移的乳腺癌患者TP53(p.R175H)未突變較多；未在血標本中檢測到Luminal A型患者有基因突變，而且年齡小于40歲的乳腺癌患者未檢測到CTC標本有基因突變。其余臨床病理特征與基因突變間無明顯相關性。

3 討 論

CTC是轉移性乳腺癌進展和生存的獨立預后因素[2]。眾多圍繞CTC數量、表型甚至單細胞測序等開展的研究進一步證實，CTC對乳腺癌轉移具有監測作用[20-21]，并已被應用于晚期乳腺癌的療效評估和預后判斷[22]。然而針對早期乳腺癌，CTC的作用還不確切。

本課題組前期針對早期非轉移性乳腺癌檢測CTC時發現，腫瘤負荷重和激素受體陰性的乳腺癌患者往往CTC數量高，HER-2陽性和三陰性乳腺癌中CTC較少表達角蛋白，提示激素受體陰性可能與CTC上皮-間質轉化有關[23]。本研究再次證實，臨床分期較高或三陰性乳腺癌患者的CTC數量較多。

本研究進一步將CTC與ctDNA基因突變相結合來分析乳腺癌患者的臨床病理特征。通過ddPCR檢測CTC中TP53和PI3K基因的突變情況，分析結合CTC和TP53/PI3K突變檢測對乳腺癌腫瘤負荷和療效監測及預后評估的作用。結果發現，在早期乳腺癌中分子分型和腫瘤指標Ki-67與CTC標本中TP53(p.R248Q)基因突變相關，腋窩淋巴結轉移情況可能與TP53(p.R175H)基因突變有關，提示這兩種基因突變檢測對確定早期乳腺癌的治療方案及判斷患者預后具有很好的指導作用。由于樣本量有限，本研究尚未發現早期乳腺癌CTC與其他臨床病理特征的相關性，這與之前的研究[16,23]結果一致。但通過檢測CTC可預先評估療效，判斷特定患者可能出現的預后情況，或用來監控病情變化。

在乳腺癌的診療全程管理中，要充分考慮PI3K基因突變可能帶來的影響。一項最新的大數據匯總分析表明，約32%的早期乳腺癌患者發生PI3K突變，編碼螺旋形區域(p.E545K、p.E542K)與編碼激酶區域(p.H1047R)的突變分別占52%和39%；PI3K突變更多見于較大年齡、ER陽性、低級別和小腫瘤，且PI3K突變與較好的臨床結局(無浸潤生存、無遠處轉移生存和總生存)顯著相關[24]。以往研究[25]還提示，PI3K(p.H1047R)突變與淋巴結轉移陰性有關，PI3K(p.E545K)突變與較大年齡有關。本研究結果與之前報道一致，PI3K(p.H1047R)突變共3例，2例發生于淋巴結陰性乳腺癌患者，而1例PI3K(p.E545K)突變發生在年齡大于40歲的乳腺癌患者。因此，今后治療乳腺癌不僅依據是否發生PI3K突變，還要根據特定的突變位點來設計診療方案。

表1 乳腺癌患者血TP53(p.R248Q)、CTC TP53(p.R248Q)、CTC TP53(p.R175H)基因突變與臨床病理特征的相關性

**P<0.01,*P<0.05

TP53突變與原發腫瘤和復發腫瘤突變的一致率高達90%[12]，在血或其他體液中檢測到TP53突變比常用的腫瘤監測指標CA125能更早發現腫瘤進展[18]。相比無突變的野生型TP53乳腺癌患者，TP53突變患者對藥物治療的反應和疾病預后更差[26]。BIG02-98臨床試驗也提示，TP53不同位點突變對預后的作用不同[27]。本研究涉及的TP53突變位點密碼子轉錄后，翻譯為不同的氨基酸，影響整個p53蛋白功能。因此不同部位TP53突變會產生不同的生物學影響。本研究檢測的血、CTC和尿三類標本基因總體突變情況無差異，提示三類標本均可作為突變檢測標本來源，但各標本內不同位點突變有差異，均是TP53(p.R175H)突變率最高；但TP53(p.R175H)在三類標本中的突變情況與患者臨床病理特征無顯著相關，僅在CTC標本中提示腋窩淋巴結轉移可能與TP53(p.R175H)基因突變有關(P=0.058)。這可能與本研究納入樣本量較少有關。有研究指出，胚系TP53突變與乳腺癌診斷年齡和HER-2狀態有關，診斷乳腺癌時年齡每增加1歲，TP53突變率減少5%，而年輕女性HER-2陽性乳腺癌的TP53突變風險增加近7倍[5]。但本研究結果與之有差別，年齡>40歲組患者TP53突變有21例(84.0%)，HER-2陰性組有18例(72.0%)。

TP53的預后價值與淋巴結轉移和腫瘤大小有關[26]。本研究中腫瘤增殖指標Ki-67指數與CTC中TP53(p.R248Q)突變相關(P=0.028)，且腋窩淋巴結轉移可能與CTC標本中TP53(p.R175H)基因突變有關(P=0.058)。這些結果提示，TP53突變與腫瘤預后可能相關，尤其是TP53(p.R175H)基因突變的患者發生淋巴結轉移的可能性較小，預后較好。而一項針對2 000多例乳腺癌患者的基因和轉錄分析表明，按乳腺癌分子分型來看，TP53突變最容易發生在三陰性乳腺癌(34%)，其次是HER-2陽性乳腺癌(22%)、Luminal B(13%)和Luminal A(5%)型乳腺癌[28]。本研究同樣揭示，乳腺癌分子分型與CTC標本中TP53(p.R248Q)突變相關(P=0.003)，提示乳腺癌不同分子分型中TP53突變率不同；但本研究各基因突變分布與既往研究不同。另外，匯總三類標本5種基因位點的總體突變情況，發現Luminal A型患者的血標本中未檢測到突變，年齡<40歲的CTC標本中未檢測到突變，這可能與Luminal A型患者較少有關。本研究中CTC在年齡>40歲組患者中檢測率高，這可能影響了40歲以下組CTC標本的基因突變檢出率。

綜上所述，本研究采用CellSearch方法對早期乳腺癌患者進行CTC檢測，并收集血、CTC和尿三類標本，通過ddPCR方法來檢測TP53和PI3K基因的突變情況，并結合CTC和TP53/PI3K突變檢測分析其對乳腺癌腫瘤負荷、療效和預后的監測作用。結果提示，在早期乳腺癌中，乳腺癌分子分型和腫瘤指標Ki-67與CTC標本中TP53(p.R248Q)基因突變相關，腋窩淋巴結轉移可能與TP53(p.R175H)基因突變有關，這為早期乳腺癌治療方案的選擇和預后判斷提供了新的依據。盡管本實驗中，CTC和TP53/PI3K突變情況與早期乳腺癌的大部分臨床病理特征無明顯相關，但根據既往文獻[19, 25-27]報道，了解掌握TP53/PI3K基因突變情況有助于針對乳腺癌患者開展個性化用藥、療效監測和預后判斷。另外，本研究首次采用尿液作為早期乳腺癌檢測標本，擴展了乳腺癌檢測有效生物標志的來源，且本研究發現三類標本的基因突變檢測結果無明顯差異，提示可以根據臨床需要獲取合適的檢測標本。由于CTC匯聚了多種腫瘤療效和預后監測的生物指標，因此檢測CTC突變基因的效能更強，更有可能在早期腫瘤中發現陽性結果。未來建立個體化的多生物指標聯合分析方法可能成為一種更有效地發現早期腫瘤進展和預后的方法。

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