攜帶血管緊張素轉換酶2基因的人臍帶間充質干細胞尾靜脈注射移植可減輕博來霉素誘導的大鼠急性肺損傷

高風英， 金文強， 王星海， 劉振威

1. 上海市建工醫院呼吸科，上海 200083 2. 上海市第一人民醫院呼吸科，上海 200080

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由心源性以外的各種直接或間接因素所引起的以急性彌漫性肺泡炎性病變為特征的肺部急性炎癥反應，是臨床常見的危重疾病，可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[1-2]。ALI發病機制復雜，發病率高，且尚無有效的治療措施，其病死率高達40%以上。因此，尋找新的有效治療方法是目前ALI臨床診治的難題。

血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)與ACE類似，是腎素-血管緊張素系統(rennin angiotensin system, RAS)的重要組成部分[3]，在ALI/ARDS疾病過程中發揮重要的保護作用[4-5]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有干細胞自我復制和多向分化潛能，逐漸被應用于肺損傷的臨床診治。MSCs體內移植能夠抑制急性肺損傷模型動物的炎癥反應，觸發修復相關的生長因子，減輕肺組織炎性反應[6-7]。但目前MSCs主要來源于骨髓，獲取途徑有限，獲取過程有創，大大制約其臨床應用。人臍帶間充質干細胞(human umbilical mesenchymal stem cells, HUMSCs)是MSCs的一種，可從廢棄胎盤組織中分離提取，來源廣泛，較骨髓來源MSCs具有更低的免疫原性，更易體外擴增，且無倫理學制約，逐漸成為組織工程和再生醫學中最具發展前景的種子細胞[8-9]。

因此，本研究基于HUMSCs的特性和ACE2對肺損傷的保護作用，采用轉染法構建攜帶ACE2基因的HUMSCs，并將其移植入急性肺損傷模型大鼠體內，觀察其對博來霉素(bleomycin, BLM)誘導的急性肺損傷大鼠肺組織的影響，探討攜帶ACE2基因的HUMSCs尾靜脈注射移植對急性肺損傷的作用及可能機制，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑：BLM(美國Sigma公司)，DMEM/F12培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；PE anti-mouse CD45、CD105，FITC anti-mouse CD29、CD34、CD44(美國eBioscience公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、ACE2抗體(美國Cell Signal公司)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，INF-γ、IL-4基因引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，TNF-α ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)。主要儀器：流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD Biosciences公司)，PCR儀、電泳儀和電源(美國Bio-Rad公司)。

1.2 HUMSCs的分離培養及鑒定 無菌條件下取正常足月剖宮產健康嬰兒臍帶，剪成約1 mm2的組織塊，將其接種于細胞培養板，加入含雙抗及10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養，待細胞生長至約80%融合時，用含胰蛋白酶的消化液消化，按104/cm2的密度傳代至細胞培養瓶中進行培養。細胞表面標志鑒定：取對數生長期第4代細胞，分別加入PE anti-mouse CD86、CD45、CD105及FITC anti-mouse CD29、CD34、CD44標記HUMSCs。采用流式細胞儀檢測HUMSCs表型。

1.3 ACE2基因轉染HUMSCs 采用TRIzol試劑從人肺組織提取總RNA，反轉錄獲得人ACE2基因的cDNA片段。構建慢病毒基因轉移載體，然后與包裝載體共轉染293T細胞，擴增病毒。再轉染綠色熒光蛋白(GFP)基因在HUMSCs內作為追蹤HUMSCs的基因。收集病毒后轉染HUMSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光陽性率來檢測轉染效率。轉染效率=發出綠色熒光的細胞數/可見光下總細胞數×100%，并測定轉染了ACE2基因HUMSCs的表型。

1.4 大鼠分組及急性肺損傷模型的建立 清潔級雄性SD大鼠120只，體質量(250±20) g，由中國科學院實驗動物中心提供。大鼠隨機均分為5組：正常對照組、BLM組、ACE2組、HUMSCs組、HUMSCs-ACE2組(n=24)。除正常對照組外，其余4組采用一次性氣管內滴注BLM(5 mg/kg)制造肺損傷大鼠模型，正常對照組滴注等體積生理鹽水(0.9%NaCl)。各組大鼠分別給予如下處理，BLM組：建立肺損傷大鼠模型后注入生理鹽水2 mL；ACE2組：建立肺損傷大鼠模型后尾靜脈注入由慢病毒攜帶ACE2基因2 mL；HUMSCs組：建立肺損傷大鼠模型后單純注入HUMSCs 2 mL，細胞數1×106；HUMSCs-ACE2組：建立肺損傷大鼠模型后注入攜帶ACE2基因的HUMSCs 2 mL，細胞數1×106；正常對照組：正常大鼠輸注等體積的生理鹽水2 mL。于肺損傷前及肺損傷后第3天、第7天和第14 天取相應標本進行檢測。生存分析：每組12只大鼠單獨用于記錄生存狀況，記錄每只大鼠的生存天數，觀察14 d研究周期內大鼠的生存狀況，計算生存率并繪制生存曲線。

1.5 觀察指標及測定方法

1.5.1 肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid, BALF)中性粒細胞、總蛋白含量測定 采用10%水合氯醛麻醉大鼠，取預冷生理鹽水灌洗支氣管肺泡，收集BALF，離心后取上清液根據BCA試劑盒說明書測定總蛋白含量，取沉淀部分經1 mL PBS重懸，常規瑞氏染色后，顯微鏡下人工計數中性粒細胞數量。

1.5.2 肺組織形態學觀察及肺損傷嚴重程度評分 制備肺組織石蠟切片，脫蠟，蘇木精染色，光鏡下觀察病變區及附近肺組織病理變化，重點對肺充血及肺出血情況、肺泡內滲出、肺泡及血管壁的中性粒細胞浸潤、肺泡壁增厚程度及肺透明膜的形成等4種情況進行評估及對肺損傷嚴重程度評分。共分為5個等級：0分為沒有損傷，1分為輕微損傷，2分為中度損傷，3分為重度損傷，4分為極重度損傷。最終將各個評分進行匯總，總分即代表肺損傷程度。

1.5.3 Western印跡法測定肺組織ACE2蛋白表達 取肺組織勻漿，離心，取上清，進行蛋白定量和免疫印跡檢查。各實驗組取等量蛋白20 μg進行電泳分析。采用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白條帶通過濕法轉至PVDF膜上，室溫下封閉，然后與抗ACE2抗體孵育過夜，洗脫一抗，加二抗(1∶1 000)孵育，洗去二抗，經過化學發光法顯色后顯影、定影。

1.5.5 肺組織水含量測定 新鮮肺組織取下后稱濕重，然后置烤箱烤至恒重，稱干質量，計算兩次肺組織質量之比，即肺組織的濕干比(W/D)以反映肺水腫程度。

1.5.6 RT-PCR測定肺組織中INF-γ、IL-4 mRNA變化 取肺組織勻漿，加入TRIzol試劑冰上提取總RNA，然后根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。IL-4引物序列，正向：5′- CTG ACG GCA CAG AGC TAT TGA -3′，反向：5′- TAT GCG AAG CAC CTT GGA AGC -3′。INF-γ引物序列，正向：5′- GCA TCT TGG CTT TGC AGC T -3′，反向：5′- CCT TTT TCG CCT TGC TGT TG -3′。β-actin引物序列，正向：5′- AGC TGC GTT TTA CAC CCT TT -3′，反向：5′- AAG CCA TGC CAA TGT TGT CT -3′。采用2-ΔΔCt法來分析數據。其中，ΔCt=Ct(目的基因)—Ct(內參基因)，ΔΔCt=ΔCt(樣品)—ΔCt(對照)。

1.5.7 ELISA法測定肺組織中細胞因子TNF-α的含量 取肺組織用生理鹽水冰上勻漿，離心后取上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測TNF-α含量。

1.5.8 肺組織中外源性HUMSCs的檢測 肺組織冷凍切片采用熒光顯微鏡觀察外源性HUMSCs攜帶的GFP在特定波長光激發下所發出的綠色熒光，了解外源性HUMSCs存留肺內的轉化效率。取肺組織樣本進行免疫組化染色，檢測肺組織中GFP的表達，同時在連續切片上檢測肺泡上皮細胞特異性蛋白cytokeratin，定位外源性HUMSCs在體內修復肺組織的情況。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，多樣本間兩兩比較采用One-way ANOVA中的Bonferroni檢驗，各項實驗重復3次，檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 HUMSCs的形態學觀察及ACE2基因的轉染效果 無菌分離的HUMSCs在CO2培養箱中常規內培養1～2 d后，顯微鏡下見部分梭形貼壁細胞，7 d后形成形態相對一致、呈集落狀態生長的長梭形細胞，14 d后形成80%融合的單層貼壁細胞層。倒置顯微鏡觀察結果(圖1)顯示：HUMSCs轉染病毒后24 h開始開始檢測到綠色熒光，熒光強度隨時間不斷增強，于第5天達到高峰。當感染復數(multiplicity of infection, MOI)=10時，GFP熒光檢測陽性細胞百分比>95%，且細胞感染后可見細胞未出現病變，細胞活力及生長狀態良好；MOI大于10時，細胞死亡率明顯增加，當MOI=80時，細胞大量死亡，故確定后續轉染最佳MOI值為10。

流式細胞儀檢測結果顯示：轉染前HUMSCs細胞表型CD29、CD44、CD105均呈陽性表達，而CD34、CD45、CD86呈陰性表達，提示所獲得的細胞符合HUMSCs特性；轉染ACE2基因后第5天其表型并未發生顯著變化，提示轉染本身及ACE2表達并未導致HUMSCs相關表型的變化。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察HUMSCs細胞ACE2基因轉染效果

A：轉染前；B 轉染后第1天；C：轉染后第3天；D：轉染后第5天. Original magnification: ×200

2.2 大鼠生存狀態分析 Kaplan-Meier生存曲線(圖2)表明：實驗開始后3～7 d內大鼠死亡率較高，其他時間段較低。進一步采用Log Rank(Mantel-cox)法比較各干預組與BLM組大鼠的生存率，結果顯示：HUMSCs-ACE2組大鼠生存率優于BLM組，差異有統計學意義(P=0.037)；ACE2組、HUMSCs組大鼠生存率與BLM組相比，差異無統計學意義(P=0.167、0.087)。結果提示HUMSCs-ACE2干預能夠減輕肺損傷導致的大鼠死亡(P<0.05)。

圖2 各組大鼠Kaplan-Meier生存曲線

2.3 BALF中性粒細胞計數及總蛋白含量的變化 結果(圖3A)表明：與NS對照組相比，經BLM刺激后的各實驗組大鼠BALF中性粒細胞計數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組大鼠BALF中性粒細胞計數在第3、7、14天較同期BLM組呈現下降趨勢，其中以HUMSCs-ACE2組降低量最明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

結果(圖3B)表明：經BLM刺激后，各實驗組大鼠BALF總蛋白量升高，其中以第3天的BALF總蛋白量表達最高；與同期BLM組相比，HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組BALF總蛋白量降低，以HUMSCs-ACE2組降低量最明顯，第3、7、14天較同期BLM對照組呈現時間依賴性下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 肺組織形態學觀察及肺損傷嚴重程度病理評分 H-E染色結果(圖4)表明：肺組織損傷在第3～7天最為嚴重，出現肺水腫，并有較多炎性細胞浸潤，肺纖維化嚴重，與動物死亡數的時間分布相符；隨后損傷有減輕趨勢，肺泡炎癥好轉，少量淋巴細胞浸潤，成纖維細胞少量增生。其中，第7天的H-E染色結果如下：NS對照組大鼠肺組織結構正常，肺泡結構完整光滑，無炎性細胞浸潤(圖4A)；BLM組肺組織水腫，少量出血，光鏡下可見大量中性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡壁破壞(圖4B)；HUMSCs-ACE2組炎性細胞浸潤明顯減少，肺損傷程度較BLM組顯著減輕(圖4E)。

肺損傷嚴重度病理評分結果(表1)顯示：與BLM相比，ACE2、HUMSCs、HUMSCs-ACE2組大鼠肺組織損傷得到不同程度的改善，尤以HUMSCs-ACE2組表現最佳，在損傷后第3、7、14天差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 各組大鼠BALF中性粒細胞計數(A)及總蛋白含量(B)的變化

圖4 損傷后第7天大鼠肺組織H-E染色結果

A: NS對照組； B： BLM組； C： ACE2組； D： HUMSCs組； E： HUMSCs-ACE2組. Original magnification:×200

表1 病程中各組大鼠肺組織損傷嚴重度評分的比較

2.5 Western印跡法測定肺組織ACE2蛋白表達 結果(圖5)表明：各時間點NS對照組大鼠肺組織ACE2蛋白表達差別無統計學意義；與NS對照組相比，經BLM刺激后，BLM組ACE2蛋白表達下降最顯著，ACE2組、HUMSCs組及HUMSCs-ACE2組ACE2蛋白受BLM誘導肺損傷后呈下降趨勢，但在第3天開始回升，HUMSCs-ACE2組總蛋白中ACE2表達增量最明顯，在第14天達到高峰，接近BLM刺激前水平，與同期BLM組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6 肺組織MPO活力及肺水腫程度的測定 結果(圖6A)表明：經BLM刺激后，各實驗組大鼠肺組織MPO活力顯著升高，在第3天達到高峰，隨后在第7天、第14天開始回落，與NS對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同期BLM組相比，MPO活性降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同期BLM組呈現時間依賴性下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，在第3天，HUMSCs-ACE2組MPO活性低于HUMSCs組，但差異無統計學意義。在第7、14天，HUMSCs-ACE2組MPO活性較ACE2組、HUMSCs組均明顯降低，提示ACE2轉染HUMSCs能有效降低肺組織中MPO活性。

結果(圖6B)表明：肺濕干比在BLM造模后較NS對照組顯著上升，HUMSCs-ACE2組在第3天達高峰后開始下降，ACE2組、HUMSCs組則在第7天達高峰(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同期BLM組相比，肺濕干比均有所降低，以HUMSCs-ACE2組降低最明顯，提示ACE2轉染的HUMSCs能協同降低肺水腫程度。

圖5 各組大鼠肺組織ACE2蛋白的表達變化

圖6 各組大鼠肺組織MPO活性(A)及肺水腫程度(B)的變化

2.7 RT-PCR測定肺組織中INF-γ、IL-4 mRNA的表達變化 結果(圖7A)表明：BLM組和HUMSCs組INF-γ mRNA表達量一直維持在較高水平，第7天達高峰，隨后隨時間推移開始下降，ACE2組及HUMSCs-ACE2組INF-γ mRNA表達在第3天達高峰，隨后在第7、14天開始下降。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同期BLM組相比INF-γ mRNA水平降低，以HUMSCs-ACE2組降低量最明顯，第3、7、14天較同期BLM組呈現時間依賴性下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。

結果(圖7B)表明：經BLM刺激后，各實驗組大鼠肺組織IL-4 mRNA表達顯著下降，在第3天達到最低量，隨后在第7、14天開始上升，與NS對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同期BLM組相比，IL-4 mRNA表達升高，以HUMSCs-ACE2組升高量最明顯，第3、7、14天較同期BLM對照組呈現時間依賴性上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖7 各組大鼠肺組織INF-γ(A)、IL-4 mRNA(B)的表達變化

2.8 ELISA法測定肺組織中TNF-α的含量 結果(圖8)表明：BLM組大鼠肺組織TNF-α含量一直維持在較高水平，在第3天達到高峰，在第7、14天隨時間推移開始下降。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同期BLM組相比，TNF-α表達下降，以HUMSCs-ACE2組降低量最明顯，第3、7、14天較同期BLM組呈現時間依賴性下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。第3天HUMSCs-ACE2組TNF-α表達高于HUMSCs組，但在第7、14天，HUMSCs-ACE2組TNF-α表達較ACE2組、HUMSCs組均明顯降低，并呈現時間依賴性，提示ACE2轉染HUMSCs能有效降低肺組織TNF-α的表達。

圖8 各組大鼠肺組織TNF-α的表達變化

2.9 肺組織外源性HUMSCs的檢測 結果(圖9)顯示：外源性HUMSCs攜帶ACE2/eGFP基因，經尾靜脈輸入體內后，在第14天可見肺組織受損處多處表達GFP陽性細胞。特異性蛋白cytokeratin檢測結果發現，該類細胞為肺泡上皮細胞，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs在肺部有轉化修復的能力。

圖9 肺組織外源性HUMSCs的檢測

A： DAPI染色； B： 直接鏡檢； C： 肺泡上皮細胞GFP免疫組化染色； D： 免疫組化染色陰性對照. Original magnification: ×400

3 討 論

本研究采用一次性氣管內滴注BLM制造肺損傷動物模型，模擬ALI的病理生理過程，通過肺組織病理學及相關炎癥指標的檢測顯示，肺組織中出現炎性滲出、水腫，肺血管膜受損和通透性增加，符合ALI的模型要求。HUMSCs是從廢棄的胎盤中分離提取，易得且來源豐富、不涉及倫理學爭議[10]。ACE2基因對AngⅡ有極高的催化效率，具有擴張血管、參與炎癥反應調控的作用[11-13]。ACE2基因缺失能加劇BLM誘導的肺損傷，而重組ACE2蛋白對急性肺損傷小鼠有保護作用[14]

本研究采用流式細胞儀對ACE2轉染前后HUMSCs進行表面標志檢測，結果顯示HUMSCs轉染ACE2基因后其表型并未發生顯著變化，提示轉染本身及ACE2并未影響HUMSCs相關表型的變化。目前尚無攜帶ACE2基因的HUMSCs對急性肺損傷的作用研究。因此，本研究擬探討攜帶ACE2基因的HUMSCs對急性肺損傷的作用，并為進一步研究其在肺損傷中的作用機制及對肺損傷的臨床治療提供理論依據。

本研究采用三質粒共轉染法在293T細胞中制備109～1010級病毒顆粒Lenti-ACE2，并轉染HUMSCs，ACE2基因進入HUMSCs內形成穩定表達，然后將HUMSCs-ACE2經尾靜脈輸入大鼠體內，同時設置GFP作為示蹤蛋白，追蹤HUMSCs在體內的變化。結果顯示攜帶ACE2/GFP基因的HUMSCs在肺組織受損處多處出現表達GFP的肺泡上皮細胞，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs在肺部有轉化修復的能力。

病理學研究和肺組織損傷嚴重程度總體評分發現，肺組織損傷在第3天和第7天最為嚴重，與動物死亡數時間分布相符，隨后損傷有減輕趨勢。經ACE2、HUMSCs和攜帶ACE2基因的HUMSCs這3種不同方法干預后，肺組織病理學和肺組織損傷得到進一步不同程度的改善，尤其以HUMSCs-ACE2組表現為佳，提示攜帶ACE2的HUMSCs在改善實驗大鼠整個病程的肺損傷上存在優勢。

通過對肺組織MPO活性和BALF中性粒細胞數目的檢測，結果顯示第3天各組MPO活性和BALF中性粒細胞數目達到高峰，其中HUMSCs-ACE2組大鼠MPO活性和BALF中性粒細胞數目與HUMSCs、ACE2組相比，在第3天后開始迅速下降，表現出改善跡象，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs對于治療肺損傷較HUMSCs或ACE2單獨治療有優勢。

細胞因子的改變是肺損傷病程中的一個重要體現。細胞因子按炎癥反應可分為促炎因子和抗炎因子，其中促炎因子主要有INF-γ、TNF-α、IL-1、TL-6等，抗炎因子主要有IL-4、TL-10等。本研究選取促炎因子INF-γ、TNF-α及抗炎因子IL-4作為研究對象，通過ELISA和RT-PCR檢測其表達水平。結果表明，經BLM刺激后，各組促炎因子INF-γ、TNF-α表達量增加，在第3天達到高峰，抗炎因子IL-4表達量下降，在第3天達到最低值，隨后的第7、14天促炎因子INF-γ、TNF-α表達量隨時間降低，抗炎因子IL-4 mRNA水平隨時間上升，均以HUMSCs-ACE2組表達量改變最明顯，提示HUMSCs-ACE2細胞移植治療對抑制促炎因子INF-γ、TNF-α的表達，提高抗炎因子IL-4的表達較單純ACE2、HUMSCs效果更佳。

綜上所述，攜帶ACE2基因的HUMSCs尾靜脈注射移植能有效降低ALI大鼠肺部炎癥滲出和血管通透性，降低肺組織中促炎因子基因水平，并能提高抗炎因子IL-4及ACE2的表達，從而減輕ALI大鼠病理損傷程度，提示HUMSCs-ACE2具有修復肺損傷的功能，且治療效果優于單純的HUMSCs或ACE2治療，其具體的作用機制仍有待進一步的研究證實。

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