上調microRNA-543表達對大鼠骨關節炎軟骨細胞的保護作用

李 坤， 張育民， 王亞康， 郭建斌

西安交通大學附屬紅會醫院關節外科髖關節病區，西安 710054

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一組由關節邊緣處的骨骼變化、關節軟骨完整性異常及關節軟骨和軟骨下骨退化引起的異質性癥候群，與多種炎性介質、細胞因子等致病因素密切相關，是老年人群普遍存在的慢性疾病，嚴重影響患者生活質量，對社會經濟也造成了巨大的負擔[1-2]。OA的發病機制復雜，軟骨細胞在細胞外基質(ECM)中的異常增殖、遷移導致的關節軟骨愈合、修復能力異常可能是其主要的致病原因[3]，這也是目前最主要的治療靶標。

微小RNA(microRNA/miRNA/miR)是長度在21～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA，可通過對靶基因mRNA進行切割或翻譯抑制，導致蛋白質表達下調，進而調控細胞增殖、凋亡等多個生物學過程[4]。研究[5-9]表明，一系列的miRNAs(miR-602、miR-608、miR-30、miR-146a、miR-183)可能參與了OA的發生發展，且與基質金屬蛋白酶(MMP)或血管細胞黏附分子-1的表達相關。

MiR-543對MMP7有調控作用，可能參與調節軟骨細胞ECM的平衡[10]，與骨肉瘤腫瘤細胞的糖酵解和增殖亢進有關[11]，但目前關于其在OA中的作用及機制尚不明確。因此，本研究基于大鼠OA模型及體外細胞實驗探討miR-543對大鼠OA模型軟骨細胞的可能作用及機制，為OA的臨床防治提供參考靶標。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 DMEM-F12培養液購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素、胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；miR-543 mimics及相應陰性對照、轉染試劑購自上海吉瑪基因化學科技有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒和反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒、鼠雙微體基因4(murine double minute 4, MDM4)、蛋白激酶B1(protein kinase B1, PKB1/Akt1)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 動物分組及OA模型的建立 30只健康SD大鼠購自濟南金豐實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(魯)20140006。大鼠常規飼料喂養，隨機均分為OA模型組及正常對照組(n=15)，正常對照組大鼠不做特殊處理，OA模型組大鼠采用0.5%水合氯醛(0.35 g/100 g)腹腔注射麻醉后切斷膝關節內側副韌帶，建立OA模型，術后每天對兩組大鼠肌內注射青霉素2×104U/kg，共3 d。1周后，每天驅趕OA模型組及正常對照組大鼠跑步30 min。

1.3 軟骨細胞的原代培養及miR-543 mimics的轉染 無菌條件下取正常大鼠雙側膝關節軟骨，切下組織一部分用于RNA抽提，另一部分置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗，300×g離心10 min，棄上清，20%胎牛血清DMEM-F12培養基37℃、適當濕度、5%CO2培養。轉染前1 d，將待轉染細胞以2×105/cm2的密度接種于12孔板，待細胞融合達60%～80%時，按Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書方法進行轉染miR-543 mimics及相應陰性對照(miR-543-NC)，驗證轉染效率后行后續實驗。

1.4 MTT法檢測軟骨細胞增殖能力 取對數生長期待測軟骨細胞，96孔板中每孔接種5 000個細胞，每組設6個復孔，同時設立無細胞的空白對照。細胞轉染miR-543 mimics后，10 ng/L IL-1β處理24 h，每孔加入5 μg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄上清，加入DMSO 200 μL/孔，振蕩10 min，酶標儀讀取光密度(D490)值，重復3次。

1.5 Real-time PCR檢測軟骨細胞凋亡相關基因及炎癥因子基因的表達 原代軟骨細胞培養于6孔板，不轉染/轉染miR-543 mimics或miR-543-NC 48 h后，加入10 ng/L IL-1β連續培養24 h，TRIzol法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA后行real-time PCR檢測待測基因表達水平，嚴格按說明書進行操作，待測基因及內參序列如表1。反應條件：95℃，3 min；40個PCR循環(95℃，15 s；55℃，20 s；72℃，20 s；83.5℃，15 s)；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s。以ABI 7500實時定量PCR系統進行實驗，收集熒光信號，繪制熔解曲線，以2-ΔΔCt法進行相對定量分析相關基因的表達水平。

1.6 Western印跡法檢測軟骨細胞凋亡相關蛋白的表達 原代軟骨細胞培養于6孔板，不轉染/轉染miR-543 mimics或miR-543-NC 48 h后提取待測細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將各組蛋白與上樣緩沖液(loading buffer)充分混合后100℃變性5 min，每孔50 μL加入到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠上樣孔，進行電泳和轉膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入按使用說明稀釋后的待測一抗4℃過夜。TBST緩沖溶液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)。37℃孵育1 h，TBST緩沖液清洗后以ECL發光液顯影，自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參分析MDM4、Akt1、Bcl-2等蛋白的表達水平。

MDM4:鼠雙微體基因4(murine double minute 4); Akt1:蛋白激酶B1(protein kinase B1, PKB1); Bcl-2:B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2); TNF-α:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α); IL-6:白細胞介素-6(interleukin-6)

2 結 果

2.1 MiR-543在OA模型大鼠軟骨組織及IL-1β誘導的軟骨細胞中的表達變化 結果(圖1)表明：大鼠OA模型組軟骨組織miR-543表達較正常對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與未接受IL-1β誘導的軟骨細胞相比，IL-1β誘導后的軟骨細胞miR-543表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 OA模型大鼠軟骨組織及IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-543的表達

2.2 軟骨細胞miR-543轉染效率驗證 結果(圖2)表明：miR-543-NC轉染組軟骨細胞miR-543表達與對照組差異無統計學意義； miR-543-mimics轉染組軟骨細胞miR-543表達較對照組明顯升高(P<0.05)。

圖2 轉染后不同組別軟骨細胞miR-543的表達

2.3 上調miR-543表達對軟骨細胞增殖能力的影響 結果(圖3)表明：與正常對照軟骨細胞相比，轉染miR-543 mimics后軟骨細胞增殖率明顯提升，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常對照軟骨細胞相比，IL-1β誘導可導致軟骨細胞增殖能力下降(P<0.05)，轉染miR-543 mimics上調miR-543表達后可逆轉IL-1β對細胞增殖的抑制作用(P<0.05)。

2.4 上調miR-543表達對骨關節炎軟骨細胞凋亡相關基因表達的影響 結果(圖4)表明：與正常對照軟骨細胞相比，miR-543 mimics轉染細胞MDM4

mRNA表達下調，Akt1、Bcl-2 mRNA表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常對照軟骨細胞相比，IL-1β誘導后細胞MDM4 mRNA表達上調，Akt1、Bcl-2 mRNA表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)；轉染miR-543 mimics可減輕IL-1β誘導的MDM4、Akt1、Bcl-2 mRNA 表達變化(P<0.05)。

圖3 上調miR-543表達對軟骨細胞增殖能力的影響

圖4 上調miR-543表達對軟骨細胞MDM4、Akt1、Bcl-2 mRNA表達的影響

2.5 上調miR-543表達對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥相關基因表達的影響 結果(圖5)表明：與正常對照組相比，IL-1β誘導后軟骨細胞炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達上調(P<0.05)；轉染miR-543 mimics上調miR-543表達可減輕IL-1β誘導的TNF-α、IL-6 mRNA表達變化(P<0.05)。

圖5 上調miR-543表達對軟骨細胞炎癥相關基因表達的影響

2.6 上調miR-543表達對骨關節炎軟骨細胞凋亡相關蛋白表達的影響 結果(圖6)表明：與正常對照組相比，轉染miR-543 mimics軟骨細胞MDM4表達下降，Akt1、Bcl-2表達上升(P<0.05)；與正常對照組相比，IL-1β誘導后軟骨細胞MDM4表達上升，Akt1、Bcl-2表達下降(P<0.05)；轉染miR-543 mimics上調miR-543表達可減少IL-1β誘導的MDM4、Akt1、Bcl-2蛋白表達的變化。

圖6 上調miR-543表達對骨關節炎軟骨細胞凋亡相關蛋白表達的影響

1：對照組； 2： miR-543-mimics； 3： IL-1β； 4： miR-543-mimics+IL-1β

3 討 論

本研究結果表明miR-543在骨軟骨炎大鼠軟骨組織中表達明顯下降，提示miR-543正常表達可能對維持軟骨細胞的正常生理功能有重要意義。MiR-543功能獲得性實驗發現，miR-543可促進軟骨細胞增殖(P<0.05)，減輕IL-1β誘導的增殖抑制作用(P<0.05)，提示miR-543表達抑制可能是OA的分子生物學病因之一，miR-543表達水平的監測對于OA的發生及病情評估有潛在的臨床價值。外源性miR-543補充對于緩解骨關節炎發展具有積極意義。

軟骨細胞異常凋亡是骨關節炎進展的重要原因之一，MDM4可定位于凋亡的關鍵細胞器線粒體，激活TP53線粒體凋亡途徑，還可結合并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2功能，促進細胞色素C的釋放，產生促凋亡作用[12]。Akt1則可調控mTOR信號通路，減少細胞凋亡[13]。MiR-543過表達的軟骨細胞與對照細胞相比，MDM4表達降低，Bcl-2、Akt1表達升高。在IL-1β誘導下，miR-543表達可減少促凋亡蛋白MDM4的釋放，提高凋亡抵抗蛋白Bcl-2、Akt1的水平。在后續研究中，還需借助生物信息學分析及熒光素酶報告實驗研究證實miR-543對MDM4、Akt1、Bcl-2是否存在直接的調控作用。

OA發病過程中，炎癥因子的過表達與OA的嚴重程度密切相關，大量炎癥因子釋放不僅會造成軟骨細胞損傷，還可影響軟骨細胞分化、誘導ECM降解[14-15]。IL-1β誘導軟骨細胞時，發現炎癥因子TNF-α、IL-6表達明顯上升(P<0.05)，提示IL-1β可造成軟骨細胞炎癥損傷，而miR-543過表達時，TNF-α、IL-6表達被抑制(P<0.05)，提示miR-543可能還有減輕炎癥損傷的作用。

綜上所述，OA大鼠軟骨組織與正常軟骨組織相比miR-543表達明顯下調。過表達miR-543可促進軟骨細胞增殖，下調MDM4蛋白表達，上調Akt1、Bcl-2蛋白表達，導致炎癥因子TNF-α、IL-6表達降低，可拮抗IL-1β誘導的增殖抑制、促凋亡蛋白上調、抗凋亡蛋白下調、促炎癥因子產生作用，具有潛在的臨床應用價值。

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