宮頸癌及癌前病變中Ki-67、P16蛋白的表達差異及診斷價值

劉 峰， 張春霞， 張 莉， 于云英

勝利油田中心醫院婦產科，東營 257000

宮頸癌是我國女性高發惡性腫瘤之一，預后差且近年來呈現低齡化趨勢，嚴重威脅女性的生命健康[1]。宮頸癌的發生與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染明顯相關，機體感染HPV后宮頸上皮可發生明顯惡性變，并逐漸由癌前病變轉變為腫瘤[2]。早期診斷和篩查HPV感染對預防和早期診治宮頸癌具有重要意義。因此，本研究通過檢測宮頸癌及癌前病變組織Ki-67、多重腫瘤抑制基因P16蛋白的表達差異，探討二者對宮頸癌及癌前病變的鑒別診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2016年8月我院收治的90例宮頸上皮內瘤變(CIN)和40例宮頸癌患者作為研究對象，選取患者的活檢病理組織標本及其一般臨床資料進行回顧性分析。入選標準：所有宮頸癌及CIN患者均經病理確診；初次原發病例；術前均未行放療、化療、藥物治療或其他內分泌治療。排除標準：急性感染；肝、腎、肺等嚴重器質性病變；非原發初診；合并其他部位惡性腫瘤。患者術后均根據實際情況給予相應的對癥治療。本研究經醫院倫理委員會審核批準，所有入選患者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色測定Ki-67、P16蛋白表達 活檢病理組織標本進行常規石蠟切片處理，對所有切片進行免疫組織化學染色，染色前1 d進行脫蠟處理，抗原修復切片后采用75%、85%、90%和100%梯度乙醇水化，室溫下3%雙氧水浸潤10 min，自來水流動沖洗3 min，然后采用純血清封閉12 h，滴加兔抗人Ki-67、P16多克隆抗體一抗(凍干粉型，0.1 mL，美國Santa Cruz公司)后置于4℃孵育過夜。次日PBS沖洗后滴加兔抗人Ki-67、P16多克隆抗體二抗(凍干粉型，0.1 mL，美國Santa Cruz公司)，37℃恒溫孵育60 min，PBS沖洗后加DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)，鏡下觀察。陰性對照采用PBS處理代替一抗[3]。

1.3 免疫組化染色結果判定標準 采用雙盲法判讀并記錄染色結果，所有切片均經2位經驗豐富的病理專家單獨讀片判斷。每張切片隨機選取5個高倍鏡(×400)視野進行結果觀察，根據細胞及其標志物染色強度和著色率進行計數分析[4]。Ki-67表達判定標準：視野內無陽性細胞表達為陰性；陽性細胞分布少于視野1/3為低表達；陽性細胞分布占視野1/3～2/3為中等表達；陽性細胞分布占視野2/3以上為高表達，中等表達及以上為陽性表達[5]。P16表達判定標準：視野內無陽性細胞表達為陰性；陽性細胞分布不足視野25%為弱陽性；陽性細胞分布多于視野25%為強陽性[6]。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行分析，計數資料采用χ2檢驗，多組間比較采用方差分析，數據不符合正態分布或方差不齊則應用非參數檢驗，檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 兩組患者基線資料及人口學特征的對比 40例宮頸癌患者年齡25～82歲，平均(53.24±4.53)歲。90例CIN患者年齡23～81歲，平均(52.46±4.26)歲。兩組患者基線資料及既往史、妊娠史、過敏史、手術史等差異無統計學意義，具有可比性。

2.2 兩組患者病變組織Ki-67、P16蛋白的表達差異 結果(圖1、表1)表明：Ki-67和P16蛋白在宮頸癌及CIN病變組織中均有一定程度的表達。CIN組織Ki-67蛋白陽性表達率隨病理分級的增高而明顯升高，高級別CIN組織Ki-67陽性表達率明顯高于低級別CIN(P<0.05)；宮頸癌組織Ki-67蛋白陽性表達率明顯高于CIN病變組織(P<0.05)。

CIN組織P16蛋白呈陰性或局灶性表達，低級別CIN組織P16陽性表達率明顯低于高級別CIN組織；宮頸癌組織P16蛋白陽性表達率高于CIN組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 免疫組化染色測定宮頸癌及CIN組織Ki-67、P16蛋白的表達

A: 低級別CIN組織Ki-67蛋白的表達，主要定位于細胞核；B:高級別CIN組織Ki-67蛋白的表達；C:宮頸癌組織Ki-67的表達；D: 低級別CIN組織P16的表達；E: 高級別CIN 組織P16蛋白的表達；F: 宮頸癌組織P16蛋白的表達. Original magnification： ×400

表1 宮頸癌及癌前病變組織Ki-67、P16蛋白的表達 n(%)

2.3 Ki-67、P16蛋白表達對宮頸癌、癌前病變的鑒別診斷價值 結果(表2)表明：Ki-67蛋白表達水平鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性和特異性分別為0%、91.11%，P16蛋白表達水平鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性和特異性分別為27.27%、100.0%。P16蛋白表達水平鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性顯著高于Ki-67，差異有統計學意義(P<0.05)。

Ki-67蛋白表達水平在區分低級別CIN與高級別CIN診斷的敏感性和特異性均為100.0%，P16蛋白表達水平在區分低級別CIN與高級別CIN診斷的敏感性和特異性分別為84.21%、80.00%，明顯低于Ki-67蛋白，但差異無統計學學意義。Ki-67、P16蛋白聯合鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性明顯優于單獨診斷(P<0.05)，聯合診斷在區分低級別CIN與高級別CIN的敏感性也明顯優于單獨診斷(P<0.05)。

表2 Ki-67、P16蛋白表達在宮頸癌及癌前病變的鑒別診斷價值 %

3 討 論

Ki-67是一種與細胞增殖相關的核蛋白，正常生理狀態下可在細胞周期的各個階段表達，在異常的有絲分裂中，Ki-67呈明顯的高表達[7]。機體Ki-67蛋白的表達水平與細胞群體的增殖能力明顯相關，可反映正常生理情況下細胞的增殖活性，對判斷病理情況下腫瘤細胞的異常激活及有絲分裂進程也具有一定的輔助作用[7]，被認為是宮頸上皮細胞鱗狀分化及異常增殖的特異性標志物之一[8]。Ki-67蛋白除在正常宮頸鱗狀上皮基底層表達外，在良性反應性增生與CIN病變中也有一定的表達。因此，在鑒別宮頸增生性病變時將其與其他抗體聯合使用可提高診斷的特異性和敏感性。

P16又稱多重腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS1)，是一個發現較早的抑癌基因，對多種腫瘤的轉移有抑制作用，可與細胞周期蛋白D1發生特異性結合，從而競爭性抑制相關復合物的蛋白活性，阻斷正常的細胞周期進程，與Ki-67共同參與細胞周期活動的調節[9]。宮頸癌前病變的診斷中P16強陽性提示宮頸有高度鱗狀上皮內瘤樣病變或宮頸癌的可能。P16在永生化的宮頸上皮細胞株中呈明顯高表達，且在感染HPV的早期宮頸上皮細胞中即可檢測到明顯的P16異常表達，提示其對宮頸病變的早期診斷具有輔助價值[10]。

本研究結果表明，高級別CIN組織Ki-67蛋白陽性表達率明顯高于低級別CIN(P<0.05)，宮頸癌組織Ki-67蛋白陽性表達率明顯高于CIN組織(P<0.05)；高級別CIN組織P16蛋白的陽性表達率明顯高于低級別CIN(P<0.05)，宮頸癌組織P16蛋白表達高于CIN組織(P<0.05)。P16在鑒別CIN和宮頸癌的敏感性高于Ki-67(P<0.05)，提示隨著宮頸癌前病變級別的增高，P16表達強度明顯增加。Ki-67和P16聯合診斷在區分CIN和宮頸癌及低級別CIN與高級別CIN的敏感性均明顯優于單獨診斷(P<0.05)。因此，在宮頸細胞學中聯合檢測P16、Ki-67蛋白表達可以發現更多的高危病例，有利于減少患者的過度創傷性診治，降低漏診率。

綜上所述，本研究結果表明Ki-67、P16的聯合診斷能明顯提高不同組織學分級CIN與宮頸癌的診斷敏感性，但相關結論仍有待進一步的大樣本研究證實。

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