FKBP51參與高脂誘導的線粒體損傷

劉 明，邱 彬，王婷婷，鄧 然，劉云波，雍偉東

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

肥胖已成為世界性的流行性疾病，并呈急劇上升趨勢，是糖尿病、心血管疾病及某些癌癥發生的危險因素。肥胖是生物體內脂質過多的狀態，現代人長期高熱量食物的飲食方式、久坐不動的生活方式以及遺傳易感性都可能會擾亂脂代謝穩態的平衡，造成脂代謝紊亂和有關器官的病理生理變化，引發肥胖、脂肪肝、高脂血癥、動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病，因此對脂質代謝的調控成為肥胖研究的熱點領域[1-3]。

線粒體是細胞內重要的亞細胞結構之一，是檸檬酸循環及氧化磷酸化進行的重要場所，有細胞“能量工廠”之稱[4]。目前的研究表明，線粒體作為細胞內脂肪酸氧化的核心細胞器，是脂肪酸氧化的主要場所，對于維持體內能量平衡尤為重要。慢性脂質積累將增強線粒體脂肪酸氧化率，增加活性氧的生成[5]。脂質攝取過量將導致脂肪在脂肪組織以外的組織中發生異位沉積，在這些組織中存儲的多余脂肪大多經無氧途徑產生有毒的脂質中間體，引起線粒體功能障礙及內質網壓力升高，最終導致細胞死亡。機體還可在NADPH氧化酶類和其他助氧化劑酶的催化下產生非線粒體來源的活性氧[4]。過多的活性氧，不僅造成線粒體功能受損，還會造成線粒體形態的變化。線粒體形態受其融合及裂變的動態平衡調節，這一過程主要受線粒體融合蛋白MFN1和MFN2等蛋白的調控，介導線粒體在細胞中的重新分布以及受損線粒體的恢復。最近研究者證實，在肥胖癥模型Zucker大鼠中，線粒體形態發生明顯變化，表現為線粒體表面積明顯增大而體積減少，表明肥胖癥中骨骼肌線粒體個體更小、線粒體網絡更細碎[6]。以上研究表明高脂誘導線粒體形態功能變化，從而影響線粒體脂肪酸代謝，增加脂滴積累。

FKBP51是一種具有肽酰脯氨酰順-反異構酶活性的免疫親和蛋白，它含有的肽重復結構域可介導蛋白與蛋白之間的相互作用。作為一種共伴侶蛋白，它能直接與HSP90等伴侶蛋白結合參與激素-受體復合物的形成及調控[7]。當前研究發現，禁食情況下小鼠下丘腦中FKBP51的高表達能夠減少糖皮質激素的負反饋，導致糖皮質激素水平升高，從而促進肥胖的發生[8]。此外，我們的前期研究發現，敲除FKBP51能夠通過調節PPARγ活性，抑制脂肪細胞的分化合成，抵制高脂飲食誘導的小鼠體內脂肪積累[9]。以上證據都表明FKBP51在脂肪形成和分化中具有重要作用。最新的研究表明，在脂肪分化過程中，FKBP51能夠在PKA信號通路的調控下穿梭于細胞核-線粒體之間，從而影響基因的表達[10]。

因此，我們推測FKBP51可能通過影響線粒體的形態與功能，調節高脂誘導下的體內脂肪分化和積累，對抗肥胖的發生。本研究利用高脂誘導肥胖小鼠模型，探討高脂飲食條件下，FKBP51基因對線粒體形態與功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性C57BL/6J小鼠12只，4周齡，體重9～11 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2012-0001]。小鼠隨機分為兩組：正常飲食組(RD)和高脂飲食組(HF)，每組6只。實驗動物飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所[SYXK(京)2011-0022]。動物實驗方案經中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會批準，批準號為ILAS-PG-2014-013。

1.2 主要試劑和儀器

高脂飼料(60 kcal% fat，D12492)購自美國Research Diets公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑購自美國Sigma公司；線粒體提取試劑盒(89801)購自美國Thermo Fisher公司；BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天生物科技有限公司；COXIV、MITOFUSIN、PHB1和FKBP51抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。使用比例均為抗體：稀釋液=1∶1000。

電子天平(精度0.01 g，上海民橋電子天平廠)；石蠟切片機(IVS-401，日本Sakura Finetek公司)；光學顯微鏡(BX50，日本Olympus公司)；化學發光成像系統(Tanon 5500，中國天能公司)；透射電鏡(JEM-1400，日本JEOL公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 高脂誘導肥胖表型的建立

小鼠4周齡時分別進行正常飲食和高脂喂養，每周稱量并記錄小鼠體重1次，連續記錄六周。小鼠脫頸處死后迅速取出肝臟組織，用10%中性福爾馬林固定，經石蠟包埋后以4 μm厚度切片，隨后進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 RNA測序及差異基因的GO本體分析

小鼠脫頸處死后在冰上迅速取出肝臟組織，利用Trizol法提取RNA，并將樣品交由華大基因測序，使用DEGseq軟件[11]進行差異基因分析，限定P值后獲得差異基因列表。通過在線工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，利用基因本體數據庫(GO)將功能相同的基因聚類到一個單元，在細胞成分上對差異基因進行注釋，并對其中線粒體相關基因功能進行分析。

1.3.3 差異基因的KEGG通路分析

利用全基因組及代謝途徑數據庫(KEGG)對同一通路的差異基因進行聚類分析。

1.3.4 電鏡觀察線粒體形態

小鼠脫頸處死后于手術臺邊取黃豆粒大小肝臟3～4塊，在2.5%的戊二醛中4℃固定2 h，用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，之后再用1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗并脫水后進行包埋并切片，并在電鏡下觀察線粒體形態。

1.3.5 肝臟線粒體蛋白提取及western blotting檢測

取上述正常和高脂飲食組雄鼠各2只，脫頸處死后取0.2 g肝臟勻漿，依據線粒體提取試劑盒說明粗提線粒體。線粒體蛋白經BCA法定量后以40 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳，轉膜封閉后孵育一抗過夜。次日孵育二抗(1∶4000)后以ECL法使用化學發光成像系統采集熒光信號。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 高脂喂養誘導小鼠肥胖表型

高脂飲食組小鼠喂養前四周體重持續高于正常飲食組小鼠；高脂喂養6周后，小鼠體重達到(37.17±1.23)g，而正常飲食組小鼠體重僅為(29.95±1.30)g，二者相比具有顯著性差異(P=0.0002，圖1A)，結果表明高脂飲食以后小鼠體重明顯增加。正常飲食組小鼠肝臟切片HE染色顯示肝細胞呈多邊形，界限清楚，胞漿豐富；高脂飲食組小鼠肝臟切片可見不同程度的肝細胞脂肪變性，肝細胞胞漿內出現大量脂肪空泡(圖1B)。結果表明高脂模型建立成功。

注：A：與正常飲食小鼠比較，*P< 0.05，***P< 0.001；B:小鼠肝臟石蠟切片HE染色。圖1 高脂飲食對小鼠體重和肝臟脂肪的影響(n=6，Bar=50 μm)Note.A：Compared with the RD mice, *P< 0.05，***P< 0.001.B:RD mice and HF mice. HE staining.Fig.1 Effect of high fat feeding on the body weight and liver fat of the mice

2.2 高脂誘導和正常飲食小鼠肝臟差異基因的GO本體分析

利用第二代高通量基因測序技術，對高脂飲食組和正常飲食組小鼠的肝臟mRNA進行表達譜測序，差異基因的P值限定為0.01后得到差異基因列表，共得到437個差異基因。利用DAVID工具對差異基因進行GO本體分析，從細胞組成上對基因進行注釋(表1)，發現差異基因主要參與線粒體、線粒體基質、線粒體內膜和細胞器膜等亞細胞結構的組成。其中，線粒體組成相關基因數量最多，對其相關基因進行功能分析(表2)，發現線粒體中基因功能大多跟氧化磷酸化相關。研究表明，線粒體是細胞內氧化磷酸化進行的重要場所，作為細胞內脂肪酸氧化的核心細胞器，對于維持體內能量平衡尤為重要。所以本研究認為在高脂飲食的條件下，細胞組成的差異基因主要集中在線粒體中，且與氧化磷酸化相關。

2.3 高脂誘導和正常飲食小鼠肝臟差異基因的KEGG通路分析

對差異基因進行KEEG通路分析(表3)，發現這些差異基因主要參與淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/葡萄糖生成、脂肪消化吸收以及不飽和脂肪酸生物合成等通路，這些通路基本都與線粒體的氧化磷酸化功能相關，與GO本體分析結果一致。

表1 高脂誘導和正常喂養小鼠肝臟差異基因的GO本體分析Tab.1 GO analysis of differentially expressed genes between the RD mice and HF mice

注：Fisher檢驗，P< 0.1；Benjamini-Hochberg校正，P< 1。

Note.Fisher’s exact test，P< 0.1.Benjamini-Hochberg correction，P< 1.

表2 線粒體中差異基因功能分析Tab.2 Functional analysis of differential genes in the mouse mitochondria

表3 高脂誘導和正常喂養小鼠肝臟差異基因的KEGG通路分析Tab.3 The KEGG pathway of differentially expressed genes between the RD mice and HF mice

注：Fisher檢驗，P< 0.1；Benjamini-Hochberg校正，P< 1。

Note.Fisher’s exact test，P< 0.1.Benjamini-Hochberg correction，P< 1.

2.4 高脂喂養引起小鼠肝臟線粒體形態變化

正常飲食組小鼠肝細胞線粒體呈橢圓形結構，嵴形態正常，糙面內質網較為豐富(圖2A)。高脂飲食組小鼠肝臟線粒體嵴模糊、斷裂甚至消失。線粒體結構不規則且有融合趨勢，表現為變形、增大甚至破裂壞死(圖2B)。

2.5 高脂誘導影響小鼠肝臟線粒體功能蛋白的表達

為進一步驗證高脂喂養對肝臟線粒體的影響，提取了肝臟的線粒體蛋白，利用western blotting技術檢測線粒體相關蛋白和FKBP51的表達。結果顯示，高脂飲食后，小鼠肝臟線粒體中融合蛋白MFN1和抗細胞增殖蛋白PHB1蛋白與內參COXIV相比，表達量顯著升高，FKBP51蛋白表達量顯著降低(圖3)。這些結果表明高脂飲食可能通過MFN1和PHB1蛋白影響線粒體的結構和功能，FKBP51基因可能在這一過程中發揮重要的調節作用。

3 討論

本研究通過高脂飲食喂養小鼠6周，發現高脂飲食組和正常飲食組小鼠體重明顯高于對照組，且HE染色顯示高脂喂養小鼠肝細胞內出現大量脂肪堆積，表明高脂誘導小鼠肥胖模型建立成功。利用第二代高通量基因測序技術，對高脂喂養和正常飲食小鼠的肝臟mRNA進行表達譜測序，以此來闡述高脂飲食對肝臟組織產生的影響，揭示其中的分子機制。共得到437個差異基因，利用DAVID工具對差異基因進行GO本體分析，從細胞組成上對基因進行注釋，可以看出差異基因主要涉及到線粒體、線粒體基質、線粒體內膜和細胞器膜等方面，對差異基因進行KEEG通路分析發現這些差異基因主要參與淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/葡萄糖生成、脂肪消化吸收以及不飽和脂肪酸生物合成等通路，這些通路基本都與線粒體的氧化磷酸化功能相關。線粒體是細胞內重要的亞細胞結構之一，是檸檬酸循環及氧化磷酸化進行的重要場所，有細胞“能量工廠”之稱[4]。線粒體在體內能量代謝的氧化磷酸化過程中發揮重要作用，這些過程影響了生物體內幾種成分的生物合成，包括氨基酸生物合成，核苷酸生物合成以及血紅素生物合成等。因此，研究高脂喂養與正常飲食小鼠RNA-seq，對于從分子水平揭示高脂飲食在生物體內的作用是一個重要突破口。

圖3 肝臟線粒體中FKBP51、MFN1和PHB1的表達Fig.3 Expression of FKBP51, MFN1 and PHB1 in the mitochondria of RD and HF mouse hepatocytes

電鏡下觀察發現線粒體形態結構發生明顯變化，提示高脂飲食導致線粒體結構改變。線粒體形態結構主要受線粒體融合蛋白MFN1和MFN2等蛋白的調控，它們通過調節線粒體融合及裂變的動態平衡影響線粒體的形態結構。其中，MFN1蛋白是線粒體膜融合的關鍵蛋白，其表達異常可導致線粒體膜結構改變，使線粒體融合分裂功能受損。PHB1是一種分子伴侶蛋白，作為一種細胞表面受體，參與細胞增殖、凋亡、轉錄以及線粒體蛋白質折疊調節等，在維持線粒體正常結構和功能方面起到重要作用[12]。通過western blotting技術分析線粒體功能相關蛋白表達，發現MFN1和PHB1表達量顯著升高，提示高脂飲食導致線粒體結構和功能改變。進一步通過western blotting技術分析，發現高脂飲食小鼠線粒體中共伴侶蛋白FKBP51表達量明顯低于對照組。

FKBP51是一種具有肽基脯氨酰順-反異構酶活性的免疫親和蛋白，含有多肽重復序列結構域(TPR)，能夠介導蛋白與蛋白之間的相互作用，作為共伴侶蛋白參與GR等多種復合體的功能調節。Taishin等[13]研究發現，FKBP51可以在線粒體中表達，是一個線粒體蛋白，起到保護細胞免受氧化應激的作用，當其不在細胞核中時，FKBP51可與GR形成復合物定位于線粒體中，其在亞細胞中的定位是由細胞動態條件改變的，當FKBP51在線粒體中表達量減少，可能會通過影響線粒體的形態和功能從而調節體內脂肪分化。

綜上所述，FKBP51通過影響線粒體形態與結構來參與高脂誘導的線粒體損傷。

參考文獻：

[1] Savage DB, Petersen KF, Shulman GI. Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance [J]. Physiol Rev, 2007, 87(2): 507-520.

[2] Wymann MP, Schneiter R. Lipid signalling in disease [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9(2): 162-176.

[3] Lewis GF, Carpentier A, Adeli K, et al. Disordered fat storage and mobilization in the pathogenesis of insulin resistance and type 2 diabetes [J]. Endocr Rev, 2002, 23(2): 201-229.

[4] Fischer F, Hamann A, Osiewacz HD. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways [J]. Trends Biochem Sci, 2012, 37(7): 284-292.

[5] Fisher-Wellman KH, Neufer PD. Linking mitochondrial bioenergetics to insulin resistance via redox biology [J]. Trends Endocrinol Metab, 2012, 23(3): 142-153.

[6] Bach D, Pich S, Soriano FX, et al. Mitofusin-2 determines mitochondrial network architecture and mitochondrial metabolism. A novel regulatory mechanism altered in obesity [J]. J Biol Chem, 2003, 278(19): 17190-17197.

[7] Lagadari M, Zgajnar NR, Gallo LI, et al. Hsp90-binding immunophilin FKBP51 forms complexes with hTERT enhancing telomerase activity [J]. Mol Oncol, 2016, 10(7): 1086-1098.

[8] Yang L, Isoda F, Yen K, et al. Hypothalamic Fkbp51 is induced by fasting, and elevated hypothalamic expression promotes obese phenotypes [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012, 302(8): E987-991.

[9] Stechschulte LA, Qiu B, Warrier M, et al. FKBP51 Null mice are resistant to diet-induced obesity and the PPARγ agonist rosiglitazone [J]. Endocrinology, 2016, 157(10): 3888-3900.

[10] Toneatto J, Charo NL, Susperreguy S, et al. [The dynamic mitochondria-nuclear redistribution of FKBP51 during the process of adipocyte differentiation is regulated by PKA] [J]. Medicina (B Aires), 2013, 73(5): 401-405.

[11] Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics [J]. Nat Rev Genet, 2009, 10(1): 57-63.

[12] Artal-Sanz M, Tsang WY, Willems EM, et al. The mitochondrial prohibitin complex is essential for embryonic viability and germline function in Caenorhabditis elegans [J]. J Biol Chem, 2003, 278(34): 32091-32099.

[13] Toneatto J, Guber S, Charo NL, et al. Dynamic mitochondrial-nuclear redistribution of the immunophilin FKBP51 is regulated by the PKA signaling pathway to control gene expression during adipocyte differentiation [J]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 23): 5357-5368.