心房鈉尿肽對基因敲除小鼠移植黑色素瘤生長的抑制作用

亓翠玲，曹靜樺，何亞軍，李夢詩，李倩明，楊 揚，王麗京

(廣東藥科大學，基礎(chǔ)學院血管生物學研究所，廣州 510006)

心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是De Bold等[1]于1981年首次在心房肌細胞中發(fā)現(xiàn)的，是鈉尿肽家族(NPs)被發(fā)現(xiàn)的第一個成員。之后發(fā)現(xiàn)了其他的成員，即腦鈉肽(BNP)[2]、C-型鈉尿肽(CNP)[3]和樹眼鏡蛇性鈉尿肽(DNP)[4]。ANP與細胞膜上的受體鳥苷酸環(huán)化酶相互作用，發(fā)揮了重要的生物學功能。ANP最主要的生物學作用是排鈉利尿，調(diào)節(jié)血壓及參與水鹽平衡等。研究表明ANP還具有其他生物學功能，如通過減少自由基的生成和抵制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到保護心肌的作用；通過重塑心肌結(jié)構(gòu)，從而改善心力衰竭的癥狀；還可通過對子宮血管重塑，對生殖等發(fā)揮重要作用。但是，ANP對黑色素瘤生長的作用未見報道。作者利用C57BL/6J背景的ANP敲除小鼠建立黑色素瘤皮下移植瘤模型，研究ANP對黑色素瘤生長的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級ANP雜合子小鼠(ANP+/-)，雄性2只，雌性6只，6～8周齡，體重18～20 g，由耿建國教授提供。C57BL/6J小鼠，SPF級，雌性，10只，6～8周齡，體重18～20 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002]。小鼠飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心，動物實驗操作也在此進行[SYXK(粵)2012-0125]，并嚴格按照廣東藥科大學動物倫理要求進行動物實驗(福利倫理審查證號：gdpulac2015014)。

1.2 主要試劑與儀器

B16F10黑色素瘤細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中；Rabbit anti-mouse Ki67抗體及rabbit anti-mouse CD31抗體購自博士德生物工程有限公司；Mouse anti-rabbit IgG購自北京中杉金橋生物有限公司。

主要儀器有PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；光學顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；全自動生物組織包埋機(PR公司)；烤片機(PR公司)；石蠟切片機和冰凍切片機(德國徠卡儀器公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 ANP純合子敲除小鼠的建立

ANP純合子敲除小鼠由ANP雜合子小鼠相互配種構(gòu)建所得。本實驗針對ANP基因設(shè)計了引物：引物1∶5′- CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG -3′；引物2∶5′- CTG TCC AAC ACA GAT CTG ATG -3′；引物3∶5′- CTG TTG CAG CCT AGT CCA CT -3′。反應(yīng)條件為: 94℃預變性3 min, 94℃ 30 s, 64℃ 1 s, 72℃ 1 s; 35個循環(huán)；72℃充分延伸2 min。擴增產(chǎn)物為700 bp。

1.3.2 皮下移植瘤模型的建立

以C57BL/6J小鼠作為對照組，ANP敲除小鼠為實驗組。對數(shù)生長期的黑色素瘤B16F10細胞，用胰酶消化離心后，用無菌的PBS重懸細胞。用臺盼藍對細胞進行染色以確定死細胞數(shù)低于5%后，在小鼠的右上肢腋下皮下接種0.2 mL的黑色素瘤細胞(1×105個細胞)。在接種后第7天每天用游標卡尺測量移植瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，移植瘤體積的計算公式為：0.52×ab2。在腫瘤細胞接種12 d時，處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織，并稱重。

1.3.3 免疫組織化學染色

將小鼠的腫瘤組織石蠟包埋、切片后進行免疫組織化學染色。切片脫蠟、水化后，放于3% H2O2-甲醇液中，37℃浸泡30 min以消除內(nèi)源性過氧化酶。PBS清洗3次后，高壓修復10 min。血清封閉50 min后，加 rabbit anti-mouse Ki67抗體或 rabbit anti-mouse CD31抗體，4℃過夜。PBS清洗3次后，加二抗，37℃孵育50 min。PBS清洗3次后，DAB染色，蘇木素復染后，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ANP敲除小鼠的鑒定與擴群

本實驗所有小鼠均為ANP雜合子小鼠(ANP+/-)，用雄性ANP+/-小鼠與雌性ANP+/-小鼠雜交，子代有雜合子、純合子和野生型三種基因型小鼠。1、2、4和6號小鼠的電泳條帶大小為700 bp，為純合子小鼠；3號和5號小鼠電泳條帶大小為700 bp和434 bp，為雜合子小鼠。接著，用ANP-/-小鼠與ANP-/-小鼠配種，對ANP-/-小鼠擴群。

注：3號和5號小鼠條帶分別為700 bp和434 bp，為ANP雜合子小鼠，1號、2號、4號及6號小鼠的條帶為700 bp，為ANP敲除純合子小鼠。M：Marker 2000 bp；ANP-/-小鼠有一條帶為700 bp；ANP+/-小鼠有兩條帶，分別為700 bp和434 bp，野生型小鼠有一條帶為434 bp。圖1 ANP基因的鑒定圖Note.Lane 3,5: ANP+/- mice; Lane1, 2，4，6: ANP-/- mice.Fig.1 Identification image of ANP gene

2.2 ANP敲除抑制了黑色素移植瘤的生長

在ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠皮下接種黑色素瘤B16F10細胞建立黑色素移植瘤模型，7 d后均形成明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。成瘤后，每天測量腫瘤的長徑和短徑，計算小鼠的腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)在對應(yīng)的時間內(nèi)ANP敲除小鼠的腫瘤體積明顯比C57BL/6J小鼠的腫瘤體積小(見圖2A)。在腫瘤接種12 d時，用斷頸法處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織并稱重，發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠的腫瘤重量明顯比C57BL/6J小鼠的腫瘤重量輕(見圖2B)。

注：與C57BL/6J小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 ANP敲除對小鼠黑色素移植瘤的作用Note.Compared with the C57BL/6J mouse，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 The effect of ANP knockout on the transplanted melanoma in mice

2.3 ANP敲除對黑色素瘤腫瘤細胞增殖和腫瘤微血管密度的作用

小鼠腫瘤組織石蠟包埋、切片后，用Ki67及CD31抗體檢測腫瘤組織中增殖的細胞及血管。對于增殖細胞的統(tǒng)計，每張切片在400倍光鏡下拍照，每張切片隨機記錄4～5個視野，計數(shù)每個視野中陽性細胞數(shù)及全部細胞數(shù)，增殖指數(shù)為增殖細胞數(shù)占全部細胞數(shù)的比值。發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠腫瘤組織中細胞增殖指數(shù)明顯比C57BL/6J小鼠少(圖3A)。關(guān)于微血管密度，每張切片在200倍光鏡下拍照，每張切片隨機記錄4～5個視野，計數(shù)每個視野中血管的數(shù)目，發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠腫瘤組織中微血管數(shù)目明顯比對照組少(圖3B)。

3 討論

ANP是廣泛分布于心臟血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及腎臟組織中由心肌細胞合成和分泌的激素。ANP主要與NPRA結(jié)合，激活G蛋白和鳥苷酸環(huán)化酶，進而促進細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷的生成[5-8]，從而利鈉利尿、舒張血管、降低血壓、參與脂質(zhì)代謝及調(diào)節(jié)免疫等[9-12]。近年研究表明ANP還對纖維化、心肌缺血再灌注損傷等具有重要作用[13-14]。但是，ANP對腫瘤生長的作用尚未見報道。

為了確定ANP對黑色素瘤的作用，本研究利用ANP敲除小鼠建立了黑色素瘤皮下移植模型。利用基因工程小鼠建立腫瘤移植瘤模型具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢：可以在基因產(chǎn)物的作用完全消除的情況下，研究單個基因在動物體內(nèi)對腫瘤的作用，更能模擬腫瘤在人類體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的過程。本實驗所用的基因工程小鼠為ANP敲除小鼠，在ANP敲除小鼠體內(nèi)ANP的功能完全缺失。利用ANP敲除小鼠及其對照C57BL/6J小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，每組小鼠的腫瘤成功率可達100%，而且腫瘤生長速度較一致，個體差異也較小，而且腫瘤長于體表，易于觀察及測量腫瘤，可以客觀地判斷ANP對腫瘤生長的作用。

注：與C57BL/6J小鼠比較，**P< 0.01，***P< 0.01。圖3 ANP缺失抑制了腫瘤細胞增殖和腫瘤血管形成(Bar=100 μm)Note.Compared with the C57BL/6J mouse，**P< 0.01，***P< 0.001.Fig.3 Deletion of ANP inhibits tumor cell proliferation and tumor angiogenesis in the mice.

本研究利用ANP敲除小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)ANP敲除顯著抑制了黑色素瘤的生長。為了進一步確定ANP敲除抑制黑色素瘤的作用，我們用免疫組化檢測了腫瘤組織中增殖的細胞及微血管密度，發(fā)現(xiàn)ANP敲除后顯著抑制了腫瘤細胞的增殖及微血管的密度。所以，ANP敲除可能通過抑制腫瘤細胞的增殖及減少微血管的數(shù)目，從而抑制了黑色素皮下移植瘤的生長。

綜上所述，ANP缺失顯著抑制了黑色素瘤的生長，但其分子機制尚不清楚，需進一步研究。進一步探討ANP與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，將對于理想的抗腫瘤治療靶點及判斷患者預后具有重要意義，而且為ANP作為治療腫瘤患者的新型藥物提供了重要依據(jù)。

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