阻斷巨噬細胞介導的PD1/PD-L1通路對小鼠結核復發的抑制作用

孫萌萌，秦 川，唐 軍，占玲俊

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，衛計委人類疾病比較醫學重點實驗室, 新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型，中國醫學科學院結核病中心，北京 100021)

結核病是危害人類健康的重要傳染病，根據WHO(World Health Organization，WHO)報告[1]，2015年全球新發結核病(tuberculosis，TB)數量約為1040萬例，有140萬人死于結核病。我國每年復發肺結核病患者占新發結核病患者的15%～20%，而復治肺結核中發展成耐藥結核的比例約為35%～55%[2]。臨床上結核治療后復發和耐藥的情況時有發生，導致結核遷延不愈[3]是耐藥結核產生的主要原因，因而控制結核病的疫情首要任務就是要積極預防結核病的復發。

PD1/PD-L1通路在某些病毒和細菌感染中[4-7]發揮作用，PD-1: PD-L1 /PD-L2通路在腫瘤和某些感染性疾病中發揮免疫抑制作用，而在結核病中的免疫作用尚不明確。已有報道[8-10]，菌株BCG(Bacillus Calmette-Guérin)和菌株H37Rv(結核分枝桿菌標準株H37RV)感染PD-1敲除小鼠的相關體內實驗顯示出PD-1/PD-L1通路相悖的結果。

本研究擬用PD-L1單抗或與異煙肼共同作用探究其對于TNF-α抗體誘導的結核復發的抑制作用。通過分析小鼠結核病急性感染期和復發期的荷菌量及病理病變，明確PD-L1抗體的作用。通過siRNA體外敲低結核菌感染的巨噬細胞上PD-L1或用PD-L1抗體阻斷PD1/PD-L1通路，用流式方法檢測巨噬細胞凋亡的情況，初步探究巨噬細胞上PD1/PD-L1通路在結核發病和復發中的作用及機制，以期能為結核病復發的臨床干預提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株和細胞結核分枝桿菌標準株H37Rv(菌號為93009)由中國藥品生物制品檢定所提供，在中性羅氏培養管中培養，37℃、5% CO2，培養4周后收菌，無菌過濾制成單細胞懸液，分裝儲存于-80℃低溫冰箱。過濾之后的菌液用細菌超聲分散計數儀分散均勻，濃度調為1.0×107CFU/mL。

RAW264.7細胞系購自賽百慷公司。培養于含10%胎牛血清、100 μmol/mL青霉素和100 μmol/mL鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養，調節細胞的傳代濃度，每2 d傳代一次。

1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠28只，4～6周齡，體重12～14 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]，[SYXK(京)2011-0022]。實驗動物的使用得到了中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準(批準號：ZLJ16001)，實驗在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所生物安全3級實驗室(國衛ABSL3-059)進行。動物在感染1周前進入生物安全3級實驗室適應。

1.3 主要試劑與儀器

分枝桿菌中性羅氏培養管(珠海貝索生物技術有限公司，中國)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒 (BD公司，美國)；Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 (BD公司，美國)；LEAFTMPurified Anti-Mouse CD274(B7-H1)(Biolegend，美國)；LEAFTMPurified Anti-Mouse TNF-α (Biolegend)、Isoniazid (Sigma，美國)；CD274 (B7-H1) PE(eBioscience，美國)；流式細胞儀(BD公司，美國)；NanoZoomer S60明場熒光切片掃描儀(日本)；細菌超聲分散計數儀(廣東體必康生物科技有限公司，中國)；siRNA(廣州銳博，AGAcGuAAGcAGuGuuGAA GATATTTGCTGTCTTTATA)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組

實驗分為A組：感染對照組、B組：異煙肼治療組、C組：異煙肼PD-L1抗體協同治療組、D組：TNF-α誘導復發組、E組：異煙肼協同PD-L1抗體自然復發組、F組：異煙肼自然復發組。

1.4.2 動物感染和取材

以1.0×107CFU/mL的H37Rv 100 μL/只尾靜脈感染C57BL/6小鼠，兩周之后分別給予異煙肼(10 mg/kg)，異煙肼聯合PD-L1單抗(每只每周50 μg)連續治療四周，之后TNF-α抗體(每只每周50 μg)誘導四周。每個時間點各組分別取4只小鼠脫頸椎處死，解剖取脾臟、肺臟、肝臟組織進行荷菌量的檢測和病理分析。

1.4.3 組織荷菌量檢測

取左側肺組織、脾頭1/3及肝腹背部的小葉，組織研磨勻漿。勻漿液用生理鹽水按照1:10的比例進行梯度稀釋，分別取10-1、10-2、10-3三個稀釋度的組織稀釋液50 μL，接種于分枝桿菌中性羅氏培養管，每個梯度各接種2管，37℃、5% CO2，培養3～4周進行菌落計數。

1.4.4 組織病理分析

余下的脾、肺、肝組織置于4%中性甲醛固定液中固定72 h，脾臟和肝臟組織分別按長軸最大橫切面進行修塊，肺組織完整分離小肺葉。組織塊經梯度酒精脫水后石蠟包埋，切片厚度為5 μm，HE染色之后，將HE片用NanoZoomer S60明場熒光切片掃描儀(日本)進行明場半自動掃片，用VDP.View 2軟件對病變組織進行定量分析。分析單位面積(mm2)的肺組織中肉芽腫面積，單位面積(mm2)脾臟內白髓內肉芽腫的面積，單位面積(mm2)肝臟內肉芽腫個數。

1.4.5 PD-L1表達的檢測方法

用6孔板每孔加2 mL的5×105cells的巨噬細胞懸液，按照MOI=1加1×106CFU的H37Rv，5% CO2、37℃孵育感染24 h，設置正常對照組和感染組。培養結束后，棄培養液，加入PBS，1000 r/min離心5 min洗滌細胞3遍。收集細胞于1.5 mL離心管中，加200 μLPBS重懸，加PE-PD-L1(eBioscience)流式抗體每孔2 μL，室溫避光孵育15 min，標記細胞。上機前100 μL 4%多聚甲醛固定15 min，用流式細胞儀檢測細胞PD-L1的表達情況。

1.4.6 PD-L1對巨噬細胞凋亡的影響

感染當天，取對數生長期的RAW264.7細胞1×106個接種到六孔板，于5% CO2、37℃、飽和濕度條件下培養，共3個組：對照組control、實驗組H37RV、PD-L1+H37Rv，每個處理組設3個復孔。第二天加入PD-L1-siRNA或PD-L1抗體，孵育1 h之后加入H37Rv感染巨噬細胞，培養4 h后消化細胞并收集細胞，加入PBS 1000 r/min離心5 min洗滌后，將細胞重懸于400 μL 1×binding buffer(BD Pharmingen PE annexin V apoptosis detection kit I，LOT:7026588)中。PD-L1-siRNA組加入5 μL FITC Annexin V和5 μL propidium iodide staining solution(PI)染色；PD-L1單抗組加入5 μL PE annexin V和5 μL7-AAD染色。室溫避光孵育15 min，加400 μL 1 × binding buffer到每個管中。每管加4%多聚甲醛200 μL固定15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠組織荷菌量分析

小鼠在感染2周后分別給予異煙肼和異煙肼聯合PD-L1進行治療4周后(圖1)相比較A組，B, C組肺、脾、肝臟荷菌量明顯減少(P<0.001)，C組較之B組荷菌量雖有下降，但是差異無顯著性。B和C組的小鼠用TNF-α抗體誘導四周后(圖1)，相比較F組，D組肺、脾、肝荷菌量明顯增加(P<0.01、P<0.001、P<0.001)；E組的肝臟和脾臟的荷菌量減少，但是差異無顯著性。與D組相比，E組肝臟和脾臟荷菌量顯著性減少(P<0.001)。

注：1：肺臟荷菌量；2：脾臟荷菌量；3：肝臟荷菌量；A:感染對照組；B：異煙肼治療組；C：異煙肼PD-L1抗體協同治療組；D：TNF-α誘導復發組；E:異煙肼協同PD-L1抗體自然復發組；F:異煙肼自然復發組；與A組比較，***P< 0.001；與D組比較，##P< 0.01，###P< 0.001。圖1 小鼠結核模型中肺脾肝不同時期的菌荷菌量(n=4)Note.1: Bacterial load in lung. 2: Bacterial load in spleen.3: Bacterial load in liver.A: infection group. B:isoniazid treatment group.C：isoniazid combined with PD-L1 monoclonal antibody group. D: TNF-α induced-relapse group. E: natural relapse inisoniazid combined PD-L1 monoclonal antibody group.F: natural relapse in isoniazid group. Compared with the group A,***P< 0.001.Compared with the group D，##P< 0.01,###P< 0.001.Fig.1 Bacterial load of the lung, spleen and liver in the M. tuberculosis-infected mice in different periods

2.2 感染小鼠組織病理變化

感染2周治療4周之后(圖3)，A組肝臟病變主要為出現大量散在的小肉芽腫，肉芽腫主要由巨噬細胞、淋巴細胞及少數中性粒細胞構成。脾臟白髓區及紅髓區可見主要由巨噬細胞組成的肉芽腫。肺臟可見肉芽腫樣病變。病理定量分析(圖2)，相比較于A組B、C組的脾臟病變明顯減輕(P<0.01)，肝脾病變顯著減輕(P<0.01，P<0.001)(圖2)，但是A組和B組的肝脾病理差異無顯著性。TNF-α抗體誘導四周之后(圖2)，D、E組肝臟、脾臟和肺臟內均可見的肉芽腫，但是E組的脾臟肉芽腫要比D組的病變面積小。進行病理病變定量分析(圖2)，相比較D組，E組的肺脾的病變程度顯著性減輕(P<0.01、P<0.05)，肝臟的肉芽腫密度也顯著降低(P<0.01)，相對于F組，E組的肺臟和肝臟的病變程度降低，但是二者差異沒有顯著性。

注：1：肺臟荷菌量；2: 脾臟荷菌量；3: 肝臟荷菌量；A: 感染對照組；B: 異煙肼治療組；C:異煙肼PD-L1抗體協同治療組；D: TNF-α誘導復發組；E: 異煙肼協同PD-L1抗體自然復發組；F: 異煙肼自然復發組；與A組比較，***P<0.001, **P<0.01; 與D組比較，#P<0.05, ##P<0.01。圖2 小鼠結核模型中肺脾肝不同時期的組織病變定量(n=4)Note.1: Bacterial load in lung.2: Bacterial load in spleen.3: Bacterial load in liver.A: Infection group. B: Isoniazid treatment group.C: Isoniazid combined with PD-L1 monoclonal antibody group. D: TNF-α induced-relapse group.E: Natural relapse inisoniazid combined with PD-L1 monoclonal antibody group.F: Natural relapse in isoniazid group. Compared with the group A,***P< 0.001, **P< 0.01. Compared with the group D, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.2 Quantitative analysis of the pathological changes in the lung, spleen and liver tissues of the M. tuberculosis-infected mice in different periods

2.3 結核菌感染巨噬細胞后PD-L1的表達

流式細胞儀檢測發現(見圖4)：H37Rv感染巨噬細胞24 h后，紅色峰(感染組)相比較藍色峰(對照組)右移，表明PD-L1表達升高。

2.4 PD-L1敲低或阻斷后對結核菌感染的巨噬細胞凋亡的影響

利用流式細胞儀檢測結核菌感染的巨噬細胞的凋亡，用PD-L1單抗干預后，巨噬細胞對照凋亡率為見(圖5A)左圖(14.4%)，H37Rv感染后巨噬細胞凋亡率見中圖(12.2%)，加入PD-L1單抗后，巨噬細胞凋亡的細胞比例見右圖(13.9%)。對3個復孔流式結果進行統計，結果見圖5 A-1， H37Rv感染巨噬細胞之后細胞凋亡率降低(P< 0.05)，加PD-L1單抗后細胞凋亡率較感染組顯著性上升(P< 0.05)。

用siRNA敲低巨噬細胞上PD-L1后檢測細胞凋亡(圖5B)，左圖為巨噬細胞對照(14.4%)，中圖為H37Rv感染巨噬細胞后凋亡情況(7.97%)，右圖為H37Rv感染后加入PD-L1-siRNA后，凋亡的細胞比例(14.0%)。對3個復孔流式結果進行統計(圖5B-1)，H37Rv感染巨噬細胞之后細胞凋亡率顯著性降低(P< 0.001)，加PD-L1-siRNA組細胞凋亡率較感染組顯著性上升(P< 0.001)。

3 討論

本研究發現，結核急性感染經過異煙肼單獨治療及PD-L1單抗協同異煙肼治療后，均可以明顯降低荷菌量和減輕病變，雖然兩者組間無顯著性差異，但是經TNF-α抗體誘導復發之后，可以看到PD-L1單抗聯合異煙肼治療組相比較單用異煙肼治療組，可以顯著降低復發期的荷菌量和病變。這表明PD-1：PD-L1通路在體內可能發揮免疫抑制作用，PD-L1單抗阻斷PD-1:PD-L1通路后，可能逆轉該通路的免疫抑制作用，從而遏制復發期荷菌量上升而表現出免疫保護作用。用H37Rv體外感染巨噬細胞，24 h后發現PD-L1的表達上升，利用PD-L1抗體阻斷或si-RNA敲低結核菌感染的巨噬細胞上PD-L1，可以促進巨噬細胞的凋亡，在抑制小鼠結核的復發中發揮作用。

上述結果與已發表的用BCG感染PD-1敲除小鼠的結論是一致的，但是與H37Rv感染的PD-1敲除小鼠的結論是相悖。但依然不能否認結核感染的宿主體內PD1/PD-L1通路發揮免疫抑制作用。究其原因，是因為：其一：用BCG和H37Rv分別感染小鼠后，PD-1通路所發揮的免疫作用不同，這種差異的產生可能與PD-L1、PD-L2的差異表達有關。小鼠感染BCG后，PD-L1高表達，而PD-L2無明顯表達變化。PD-1:PD-L1通路使Th1型細胞免疫功能受到損傷，可以恢復Th1型細胞免疫的功能，從而在體內表現出免疫保護作用，即PD-1敲除后的小鼠脾臟荷菌量比野生型小鼠低。H37Rv感染小鼠后，PD-L1和PD-L2均出現高表達，可能是因為PD-1：PD-L1和PD-1：PD-L2發揮相反的作用，即PD-1：PD-L1發揮免疫抑制作用，PD-1：PD-L2發揮免疫保護作用。其二∶PD-L1和PD-1免疫功能抑制作用的機制不盡相同。在腫瘤和多種慢性感染中[11]，PD-1通過與PD-L1、PD-L2結合，從而抑制T細胞的TCR信號，進一步下調免疫激活因子和與存活相關的蛋白表達。而在APC上表達的PD-L1存在于MASK/細胞因子/STAT-3依賴模式中∶在STAT-3的調控下，TLR-APC在IL-6和IL-10上高表達，同時抑制STAT-3活化，進而阻斷PD-L1的表達。所以，在阻斷PD-1和PD-L1后免疫反應存在一定的差異。

而PD：PD-L1通路的體外結果與本研究組PD-L1抗體干預的結果一致，雖然已報道的PD-1敲除小鼠結果與之相左，依然提示小鼠體內PD1：PD-L1通路可能發揮免疫抑制 作用，其原因是因為PD-1敲除小鼠可能由于敲除導致的自身免疫過強使結核加重，然而，其精確作用和機制需要深入研究。

注：從左到右分別為脾、肝、肺的組織病變圖；HE染色:大圖是×12.5倍，左上角小圖為×100倍；脾、肝和肺組織中標記處為病變。圖3 小鼠結核模型中肺脾肝不同時期的組織病理改變(n=4)Note.Figures from left to right stand for pathological changes in the spleen, liver and lung tissues, respectively, HE staining. Magnification was ×12.5 of the larger picture, ×100 of the upper left insets. The markers on the spleen, liver and lung tissue pictures are the disease lesions.Fig.3 Pathological changes in the lung, spleen and liver tissues in the M. tuberculosis-infected mice in different periods

注：A為巨噬細胞陰性對照；B為H37Rv感染巨噬細胞24 h的結果；紅色峰表示感染細胞PD-L1的表達；藍色峰表示未感染細胞PD-L1的表達。圖4 感染H37Rv的巨噬細胞PD-L1的表達Note.A stands for negative control macrophages. B stands for the result of macrophages H37Rv-infected for 24 hours.Red curve represents the expression of PD-L1 of infected macrophages.Blue curve represents the expression of PD-L1 of uninfected macrophages.Fig.4 PD-L1 expression of the macrophages infected by H37Rv

注：與Control組比較，*P< 0.05,***P< 0.001；與H37Rv組相比較， #P< 0.05,###P< 0.001。圖5 PD-L1對感染的巨噬細胞的凋亡影響(n=3)Note.Compared with the control group， *P<0.05,***P<0.001. Compared with the H37Rv group， #P< 0.05, ###P< 0.001.Fig.5 Effect of PD-L1 on apoptosis in the infected macrophages

巨噬細胞作為機體天然免疫系統中重要的效應細胞，其細胞凋亡作為一種有利于宿主清除結核菌的方式，及通過防止結核菌逸散造成二次感染[12]，在機體與結核桿菌的抗爭中起著非常重要的作用。體外實驗發現，敲低PD-L1或用抗體阻斷均可以逆轉結核感染中PD1：PD-L1通路對巨噬細胞凋亡的可能抑制作用，有效促進結核菌的清除并防止結核菌逸散造成的二次感染，即抑制結核病的復發。該作用需要在細胞上PD-L1特異性敲除的小鼠中深入論證。

綜上所述，阻斷PD1:PD-L1通路可以抑制結核病的復發，該抑制作用與促進巨噬細胞凋亡有關。

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