皮質酮誘導小鼠抑郁伴發的學習記憶損傷

范琳犀，楊玉潔，姜 寧，陳遠偉，劉新民*，王 瓊*

(1.西南醫科大學附屬中醫醫院/中葡中醫藥國際合作中心，四川 瀘州 646000； 2.西南醫科大學藥理教研室，四川 滬州 646000；3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所， 北京 100193； 4.云南中醫學院藥學院，昆明 650500)

現代社會高強度、高壓力的生活和工作，使人們的身心長期處于應激狀態，導致抑郁癥頻發[1]。大量研究表明隨著病情的發展，抑郁癥患者出現不同程度的學習記憶障礙[2-3]。用皮質酮給藥常用于抑郁動物模型的建立[4-5]，國外對皮質酮口服4周用于誘導的動物抑郁樣行為表現伴發學習記憶能力影響也有報道。本實驗通過皮頸下注射不同劑量的皮質酮，觀察動物抑郁樣行為的改變，進而研究其對小鼠學習記憶功能的影響，為抑郁伴發學習記憶障礙及其防護藥物的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，60只，6～8周齡，體重(20±1)g，由北京維通利華實驗動物公司提供[SCXK(京)2016-0011]。實驗期間喂養于中國醫學科學院院藥用植物研究所實驗動物房[SYXK(京)2013-0023]，供給充足的標準飼料和清潔水，光照時間12 h/12 h(照明/黑暗)，室溫22℃～25℃，濕度條件為(55±10)%。動物適應喂養7 d。本實驗遵循實驗動物3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

皮質甾酮(梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，7XJCB-GP)；吐溫-80(Sigma，P1754)；二甲基亞砜(DMSO，Amresco，3116C455)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，D16081311)。

小鼠自主活動實時監測系統、小鼠懸尾實時監測系統、小鼠強迫游泳實時檢測系統、小鼠水迷宮實時測試系統(由中國醫學科學院藥用植物研究所、中國航天員科研訓練中心和北京康森益友科技有限公司聯合研發)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及給藥

C57BL/6J小鼠40只按體重分成4組，空白組、皮質酮20 mg/kg低劑量組、皮質酮40 mg/kg中劑量組和皮質酮80 mg/kg高劑量組，每組10只。C57BL/6J小鼠20只按體重分為2組，空白組、皮質酮40 mg/kg組，每組10只。空白組皮下注射含0.1% DMSO(二甲亞砜)和0.1% 吐溫-80的0.9%氯化鈉注射液的溶媒，皮質酮組皮下注射皮質酮溶液(含溶媒，使用前混勻)，給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續造模21 d[6-7]，行為學檢測期間依然給予皮質酮注射。

1.3.2 空場實驗[8-9]

在自主活動實時監測系統測試箱中心將小鼠輕輕放下，適應3 min，然后計算機監測動物在后10 min內總的及中央區的運動路程、運動時間、運動速度等指標，分析動物的自發活動情況。

1.3.3 小鼠懸尾實驗[10-11]

將小鼠以倒掛的狀態固定于懸尾實時監測系統實驗箱中, 調整支架高度，從而使小鼠懸空大約離箱底5 cm，適應2 min, 軟件自動統計小鼠后4 min的不動時間。

1.3.4 小鼠強迫游泳實驗[12-13]

用強迫游泳監測小鼠的活動狀況。將小鼠置于小鼠強迫游泳實時監測系統實驗桶中，水溫為25℃，適應2 min, 軟件自動統計小鼠后4 min內的不動時間。

1.3.5 物體位置識別實驗[14-15]

該實驗分為3個階段：適應期、熟悉期、測試期。適應期3 d，每天將實驗動物單個放入物體認知實驗箱內，熟悉10 min。第4天，熟悉期時，將兩個完全相同的物體放入試驗箱內相鄰的磁鐵處固定，記錄小鼠5 min內對兩物體的探索總時間。間隔30 min后，進入測試期。測試期將其中一個物體移到另一物體的斜對角，記錄5 min內小鼠對兩物體的探索時間。用辨別指數(DI)來評價動物的學習記憶能力，辨別指數計算公式為DI=(N-F)/(N+F)×100%，其中N為新物體探索時間，F為熟悉物體探索時間。

1.3.6 Morris水迷宮實驗[16-17]

用小鼠水迷宮實時監測系統監測小鼠的活動狀況。實驗分為定位導航階段和空間探索階段。定位航行階段，共6 d，每天訓練3次，每次訓練前后各適應15 s，檢測時間為90 s，若時間范圍內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其逃避潛伏期；若動物沒有發現平臺，訓練結束，其逃避潛伏期記錄為90 s。空間探索階段，撤去平臺，將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，監測其在90 s內動物的總游程、平均速度，以及穿過原平臺所在位置的速度和穿臺次數。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同劑量皮質酮對小鼠空場實驗的影響

如表1所示，與空白組比較，皮質酮組20 mg/kg能減少空場實驗中的中央區運動路程和中央區運動路程比率(P<0.05)；皮質酮組40 mg/kg能明顯減少空場實驗中的中央區路程/時間、中央區運動路程/時間、中央區運動路程比率/時間比率(P<0.05)；皮質酮組80 mg/kg能明顯減少空場實驗中的中央區路程、中央區運動路程/時間、中央區運動路程比率(P<0.05)；而皮質酮各劑量組的總路程、運動時間和運動速度等指標與空白組相比，差異無顯著性。

2.2 不同劑量皮質酮對小鼠懸尾實驗的影響

如圖1所示，與空白組相比較，皮質酮組40,80 mg/kg的懸尾不動時間顯著增長(P<0.05或P< 0.01)。

2.3 皮質酮40 mg/kg對小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間的影響

研究皮質酮40 mg/kg對小鼠抑郁樣行為的影響，結果如圖3所示，皮質酮組的懸尾不動時間與空白組相比較明顯增加(P< 0.05)；強迫游泳實驗皮質酮組的不動時間顯著高于空白組(P< 0.01)。

2.4 中劑量皮質酮對小鼠物體位置識別實驗的影響

選用40 mg/kg皮質酮造模，研究其對小鼠物體位置識別影響，如圖4所示，在熟悉期，與空白組比，皮質酮給藥組小鼠對物體探索總時間減少，但差異無顯著性；在檢測期，與空白組比較，皮質酮給藥組小鼠的相對辨別指數顯著降低(P< 0.05)。

表1 不同劑量皮質酮對小鼠的空場實驗的影響Tab.1 Effect of different doses of corticosterone on open-field test in the mice

注：與空白組相比較，*P< 0.05。

Note.Compared with the control group，*P< 0.05.

注：(A)空白組；(B)皮質酮組20 mg/kg；(C)皮質酮組40 mg/kg；(D)皮質酮組80 mg/kg；與空白組相比較，*P< 0.05。圖1 不同劑量皮質酮對小鼠懸尾實驗不動時間的影響Note.(A)Control group.(B)Corticosterone 20 mg/kg group.(C)Corticosterone 40 mg/kg group.(D)Corticosterone 80 mg/kg group. Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.1 Effect of different doses of corticosterone on immobility time in tail suspension test of the mice

注：與空白組相比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 皮質酮40 mg/kg對小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間的影響Note.Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 Effect of corticosterone 40 mg/kg on immobility time in tail suspension test and forced swimming test of the mice

2.5 中劑量皮質酮對小鼠Morris水迷宮實驗的影響

選用40 mg/kg皮質酮造模，研究其對小鼠Morris水迷宮實驗的影響，結果如圖3所示，在小鼠水迷宮空間探索階段，皮質酮組相對于空白組逃避潛伏期均增加，在第3、4、6天的潛伏期明顯多于空白組(P< 0.05)；如圖5所示，在小鼠水迷宮空間探索階段，與空白組比較，皮質酮組在水迷宮空間探索的目標象限穿臺次數、總游程、平均速度、目標想象游程、目標象限速度有明顯下降(P< 0.05)。

注：與空白組相比較，*P< 0.05。圖3 皮質酮40 mg/kg對小鼠水迷宮定位導航階段潛伏期的影響Note.Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.3 Effects of corticosterone 40 mg/kg on the escape latency in Morris water maze (place navigation) of the mice

3 討論

皮質酮是嚙齒類動物腎上腺皮質中合成的主要腎上腺皮質激素(即糖皮質激素)，用于調節應激反應和代謝過程。下丘腦-垂體-腎上腺皮質HPA軸與腎上腺皮質激素相互調節維持機體的功能[18]，而長期大量的腎上腺皮質激素的攝入可導致HPA軸功能的紊亂，從而導致抑郁癥癥狀的出現[19-20]。研究發現長期、高水平的糖皮質激素可激活海馬糖皮質激素受體，造成海馬組織的損傷，出現情緒及學習記憶障礙[21-22]，同時發現抑郁癥可導致認知功能的改變[23]。據Gregus等[24]的研究發現不斷重復的給予動物大量的皮質酮可導致動物抑郁樣行為的改變，且傷害性小周期相對較短，為進一步探討皮質酮注射對機體的影響，本實驗通過皮質酮皮頸下注射的方式，通過空場、懸尾、強迫游泳、物體位置識別、水迷宮等實驗來系統觀察皮質酮對動物的抑郁樣行為伴發學習記憶能力改變。

研究報道在空場實驗中，當動物在中央區的運動路程等指標顯著減少時，顯示動物對新環境的好奇度降低，表現出抑郁癥樣的特征[25]；在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間增加則是“絕望”無助樣行為的表現[26]，當動物出現抑郁樣行為時主要表現為快感缺失和無助樣行為。本實驗發現中、高劑量給藥組在空場實驗中能明顯減少動物在中央區的路程、時間、運動路程比率、運動時間比率，表明模型動物對新環境的好奇度降低，在懸尾實驗和強迫游泳實驗中，模型動物的懸尾和強迫游泳的不動時間顯著增加，說明慢性皮質酮皮下注射給藥引起了小鼠抑郁樣行為的改變，與文獻報道相一致[27-28]。

注：(A)空白組；(B)皮質酮組40 mg/kg；與空白組相比較，*P< 0.05。圖4 皮質酮40 mg/kg對小鼠物體位置識別實驗的探索總時間和相對辨別指數的影響Note.(A)Control group.(B)Corticosterone 40 mg/kg. Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.4 Effect of corticosterone 40 mg/kg on the total exploration time and discrimination index of object location recognition in the mice

注：(A)總游程/cm；(B)目標象限游程/cm；(C)平均速度/cm/s；(D)目標象限速度/cm/s；(E)目標象限穿臺次數；與空白組相比較，*P< 0.05。圖5 皮質酮40 mg/kg對小鼠水迷宮空間探索階段活動的影響Note.(A)Swimming distance, cm.(B)Swimming distance in target quadrant, cm.(C)Swimming speed, cm/s.(D)Swimming speed in target quadrant, cm/s.(E)Number of target crossing. Compared with the control group,*P< 0.05.Fig.5 Effects of corticosterone 40 mg/kg on mice in the Morris water maze (spatial probe) test

物體位置識別實驗用于評估短期空間學習能力的方法，是檢測動物對新穎物體偏好性原理基礎上的自發狀態下的物體識別記憶能力的一種方法[29]。在物體位置識別實驗中發現，皮質酮慢性皮下注射給藥能使小鼠對物體位置識別的相對辨別指數顯著減少，說明皮質酮損害了小鼠的物體位置識別能力[30]。Morris水迷宮實驗是用于評價動物的長期空間記憶和參考記憶的實驗方法[31]，且定位航行的潛伏期和空間探索階段的穿臺次數主要用于動物的空間學習和記憶能力。本研究采用慢性皮下注射的方式給予小鼠皮質酮3周后，發現皮質酮組動物在Morris水迷宮實驗中的定位航行潛伏期顯著增加，在空間探索期在平臺象限的總游程、平均速度、游程、速度均有明顯下降，且穿臺次數明顯降低，表明皮質酮慢性皮下注射損害了動物的空間學習和記憶能力。本實驗從短期和長期的實驗方法檢測中發現，小鼠的空間學習能均受到損傷。

綜上，本研究通過連續21 d慢性皮下注射的方式給予小鼠皮質酮40 mg/mL，誘導了小鼠抑郁樣行為的改變，同時也對動物的空間學習記憶能力造成了損傷，為抗抑郁藥物的開發提供初步的參考。

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