體外染色體畸變試驗染色體標本制備的質(zhì)量控制

賈慶文，英 永，馬 會，朱春花，高 梅,2*

(1.山東省藥學科學院，山東省化學藥物重點實驗室，濟南 250101； 2.山東師范大學生命科學學院，山東省動物抗性生物學重點實驗室，濟南 250014)

染色體是細胞核中遺傳物質(zhì)的主要載體，環(huán)境中有害因素或致突變物作用于機體或培養(yǎng)的細胞后可導致染色體畸變，體外細胞染色體畸變試驗，是一項致突變性試驗，用于檢測體外細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性，亦是藥物遺傳指導原則推薦的評價藥物遺傳毒性的重要體外試驗[1]。中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)，易在體外建立細胞系，便于控制試驗條件，重復性好，自發(fā)突變率低，染色體數(shù)目正常非突變型為25條，便于分析，是進行染色體畸變試驗常用細胞。CHL細胞體外染色體畸變試驗在整個試驗過程中，特別是收獲細胞制備染色體玻片過程中，操作步驟繁瑣，時間較長，任何一個步驟操作不當，均可能影響制備的染色體標本的最終效果，甚至導致試驗失敗。本實驗室經(jīng)過長期的試驗和不斷探索，制作的染色體標本分散良好，長短適用，質(zhì)量穩(wěn)定，為染色體的核型分析及進一步研究染色體的數(shù)目、結構畸變奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞株

中國倉鼠肺細胞(CHL細胞)購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco公司；新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；注射用絲裂霉素，北京索萊寶科技發(fā)展有限公司；注射用環(huán)磷酰胺，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；S9，Moltox公司。

Thermo 3111二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；BDS200倒置生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司；DM LS2顯微鏡，德國Leica公司；SW-CJ-2FXS超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗前質(zhì)量控制

對所用細胞進行細胞支原體及核型檢查，確認無支原體污染，畸變率<5%方可用于實驗。

1.3.2 試驗中質(zhì)量控制

1.3.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞置RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每500 mL RPMI 1640培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素各每毫升100單位，按10%加入新生牛血清配成完全培養(yǎng)液。試驗前1 d，取生長良好的CHL細胞，接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶(每瓶5 mL)，接種濃度為每毫升105個，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.3.2.2 細胞與受試物的接觸

陰性對照組：1640完全培養(yǎng)基。陽性對照組：不加S9混合液時為注射用絲裂霉素，染毒6 h濃度為0.15 μg/mL，染毒24 h濃度為0.05 μg/mL；加S9混合液時為注射用環(huán)磷酰胺，濃度為10 μg/mL，染毒6 h[2-3]。細胞放入37℃、5% CO2箱，染毒6 h和24 h換液，洗3遍。各組于終止培養(yǎng)前4 h加入秋水仙堿，終濃度為0.4 μg/mL。

1.3.2.3 染色體標本的制作[4-5]

收集細胞：棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次。胰酶消化，待細胞從瓶壁脫落時終止消化，將細胞懸液轉移至玻璃離心管中，混勻，1000 r/min離心5 min，棄去上清液。

低滲：在離心管中加入0.075 mol/L KCl溶液8 mL，吹打細胞(動作宜輕，否則易致細胞破裂)，使細胞分散成懸浮狀態(tài)，將離心管放入于37℃水浴中低滲10～20 min，后加入甲醇和冰醋酸(3∶1)固定液1 mL預固定，1000 r/min離心10 min，棄去上清液。

第一次固定：加入固定液6 mL，混勻；固定20 min，1000 r/min離心10 min，倒掉上清液.

第二次固定：再次加入固定液6 mL，混勻；固定20 min，1000 r/min離心10 min，倒掉大部分上清液。吸管吹打混勻細胞沉淀物，制成0.5～1.0 mL細胞懸液。

制片：先將洗凈的載玻片保存于冰水中備用。自冰水中取出載玻片，傾斜放置，吸取細胞懸液滴在玻片一端約1/3處，輕吹細胞懸液使之擴散。在酒精燈上微火加熱玻片底部(無細胞的一面)，使細胞固定于玻片上，空氣中自然晾干。

染色：將玻片放入Giemsa工作液中，染色10～20 min，然后取出玻片用水沖洗，置空氣中晾干。

1.3.3 閱片質(zhì)量控制

試驗各組選擇分散較好的200個中期分裂相細胞，記錄染色體形態(tài)的變化。染色體結構畸變類型主要包括裂隙(在計算染色體畸變率時不計入其中)、斷裂、斷片、缺失、微小體、環(huán)狀染色體、單體互換等，結果以百分率(%)表示。細胞畸變率(%)=(細胞畸變數(shù)/分析細胞總數(shù))×100%。染色體的選擇：先在低倍鏡下選擇細胞完整、輪廓清晰，染色體無重疊、分布良好的載玻片，再用高倍鏡進行分析。染色體畸變判斷標準：細胞畸變率<5%為陰性(-)；細胞畸變率>5%為可疑(±)；細胞畸變率>10%為陽性(+)；細胞畸變率>20%為陽性(++)；細胞畸變率>50%為陽性(+++)[6]。

2 結果

本實驗室近年來細胞染色體畸變試驗標本制備成功率較高，染色體形態(tài)和分布良好，長短適中，便于分析(見圖1、圖2)。陰性對照組在有S9和無S9兩種測試條件下，染色體結構畸變率均小于5%；注射用絲裂霉素在0.15 μg/mL濃度下，CHL細胞染色體畸變率為22.5%～41.5%，在0.05 μg/mL濃度下染色體畸變率為21.5%～42%；環(huán)磷酰胺在10 μg/mL濃度下，并有S9活化條件下染色體畸變率為25.5%～37.5%。陽性誘變劑誘發(fā)的CHL細胞染色體畸變率顯著增高。染色體畸變試驗失敗或制備的染色體影響鏡檢，導致試驗失敗的因素也很多，總結實驗過程中的失敗案例，主要有以下幾個原因：

一是細菌污染。在器皿消毒不徹底、細胞培養(yǎng)、加入培養(yǎng)液、培養(yǎng)液污染、培養(yǎng)觀察時被細菌污染，此時所培養(yǎng)的細胞因缺少營養(yǎng)或培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積而逐漸死亡，導致實驗失敗。或者細胞培養(yǎng)前期未受污染，而在加入受試物或更換培養(yǎng)液培養(yǎng)時被細菌污染(后期污染)，此時仍可見染色體[7]。(見圖3)。

二是染色體聚集。秋水仙素用量太多，會導致染色體的過分凝縮；低滲時間不足則染色體聚集在一起，分散不開；滴片時細胞懸液濃度過濃；細胞懸液未充分吹打均勻；載玻片未在冰水中浸泡；滴片高度距離不夠。(見圖4)。

三是染色體分散過度。低滲時間過長；離心速度過高；離心后吹打用力過大；滴片距離過高。使細胞膜破裂，導致染色體過度分散。(見圖5)。

圖1 分散良好的染色體標本(×200)Fig.1 Well dispersed chromosome specimens

圖2 分散良好的染色體標本(×400)Fig.2 Well dispersed chromosome specimens

圖3 污染的染色體標本(×200)Fig.3 Contaminated chromosome specimens

圖4 染色體聚集的標本(×200)Fig.4 Aggregated chromosome specimens

圖5 染色體分散過度的標本(×200)Fig.5 Excessively scattered chromosome specimens

3 討論

體外染色體畸變試驗中，所制備的染色體成功與否，主要有幾個判斷點，①細胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。②染色體形態(tài)和分布良好，染色體長短適中。③最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辨認。④所觀察的細胞處于同一有絲分裂階段，即染色體螺旋化程度或染色體長短大致相同。⑤在所觀察的細胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響計數(shù)。

通過試驗過程中的質(zhì)量控制，可顯著提高染色體標本的質(zhì)量及畸變的檢出率。影響染色體標本制備的因素很多，可從以下幾個方面進行質(zhì)量控制：

3.1 CHL細胞培養(yǎng)

顯微鏡下生長良好的細胞透明度大、折光性強、輪廓清晰。生長不良時，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細胞間空隙加大、細胞形態(tài)不規(guī)則。若因缺乏營養(yǎng)，使細胞營養(yǎng)不良而導致細胞分裂較少或停止分裂或細胞死亡；培養(yǎng)時間過長，不及時收獲細胞，而導致細胞多層重疊，細胞老化或死亡，直接影響試驗質(zhì)量。CHL細胞用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，pH 7.2～7.4，小牛血清的加入量一般為10%～20%；及時鏡檢細胞生長情況，密度不應過大，一般單層覆蓋培養(yǎng)容器表面，細胞之間有一定的間隙時，即可收獲細胞。

3.2 秋水仙素處理

染色體畸變試驗中加入秋水仙素的劑量、作用時間與獲得的中期細胞數(shù)量、染色體長短密切相關。加入秋水仙素的量過多，作用時間過長，會導致染色體過分凝縮，長度短小；加入的秋水仙素劑量過小，作用時間過短，則分裂中期分裂細胞少甚至無中期分裂相，染色體稀少。若秋水仙素劑量大，則作用時間短；秋水仙素劑量小，則作用時間適當延長[8-10]。

3.3 低滲

低滲處理是染色體玻片制備的關鍵環(huán)節(jié)。低滲時間過長，可引起細胞破裂，染色體分散在整個片子，染色體丟失；低滲時間不足，細胞膨脹度不夠，染色體聚集呈團狀，分散不好，不利于核型分析。此外，外界溫度對低滲效果也有影響，夏天低滲時間稍短，冬天可適當延長[8-10]。

3.4 離心

離心時離心力不能太高，低滲后細胞膨脹，離心速度過高，細胞容易破裂，導致染色體丟失；離心速度過低，則細胞不能沉淀，收集不到細胞[11-13]。

3.5 固定

固定的目的是維持染色體的形態(tài)，固定液采用甲醇:冰醋酸=3∶1，需現(xiàn)用現(xiàn)配。固定液須緩慢加入低滲后的液體中，吹打細胞，使細胞分散成懸浮狀態(tài)，吹打動作易輕柔，因低滲后細胞通透性增強，如果動作幅度過大，細胞容易破裂。固定時先要預固定，此步驟雖簡單卻很不能省略，可防止細胞在加入大量固定液時凝結成塊，隨后再固定2次。固定處理需保證足夠的固定液用量及固定時間，以及細胞與固定液的充分混勻[14]。

3.6 滴片

滴片時先用固定液制成細胞懸液，適當調(diào)整懸液濃度，固定液的加入量應視細胞而定。滴片用的玻片應提前冷凍或在冰水中浸泡，且清洗干凈，滴片高度為30～50 cm為宜，高度過低，染色體分散不開，過高則細胞膜破裂，導致染色體分散過度。吸取細胞懸液滴在玻片一端約1/3處，輕吹細胞懸液使之擴散，這樣可使染色體分散較好。在酒精燈上微火加熱玻片底部(無細胞的一面)，使細胞固定于玻片上[15-16]。

3.7 染色

染液使用Giemsa原液與9份磷酸緩鹽沖液(pH 7.4)混合而成，臨用時配制，染色10～20 min。染色完畢，立即用自來水輕輕沖洗干凈玻片上的染料，再用純水沖洗，用紗布或濾紙擦干玻片背面的水滴，空氣中自然晾干。pH太高，染色體易被染成藍色，不易觀察，染液濃度過高、染色時間太長，染色體著色太深，影響染色體結構的觀察[17]。

總之，目前染色體制備過程沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制標準，各實驗室環(huán)境質(zhì)量、人員技術、所用試劑品質(zhì)，均能影響所制備的染色體標本質(zhì)量。各實驗室應結合自己實驗室情況，不斷加強人員培訓，提高制備成功率。體外染色體畸變試驗細胞染色體標本制備的每一個步驟都很關鍵，必須嚴格按照操作規(guī)程，掌握每一個步驟的原理，細致、耐心、科學地操作，才能制備出好的標本，為今后實驗研究提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

參考文獻：

[1] 【ZH】GPT2-1, 藥物遺傳毒性研究技術指導原則 [S]. 國家食品藥品監(jiān)督管理局， 2007

[2] Kasamatsu T, Ogura R, Ikeda N, et al. Genotoxicity studies on dietary diacylglycerol (DAG) oil [J]. Food Chem Toxicol, 2005, 43(2): 253-260．

[3] Hori H, Takayanagi T, Kamada Y, et al. Genotoxicity evaluation of sesamin and episesamin [J]. Mutat Res, 2011, 719(1-2): 21-28.

[4] 袁伯俊, 王治喬. 臨床前安全性評價與實踐 [M]. 第1版. 北京: 軍事醫(yī)學科學出版社, 1997: 89-102.

[5] 袁伯俊, 廖明陽, 李波. 藥物毒理學實驗方法與技術 [M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2007: 268-271.

[6] 彭雙清, 郝衛(wèi)東. 藥物安全性評價關鍵技術 [M]. 第1版. 北京: 軍事醫(yī)學科學出版社, 2013: 238-240.

[7] 昌業(yè)偉, 李鳳, 唐瑜, 等. 人外周血染色體標本制備方法影響因素的分析 [J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2014, 22(5): 148-149, 13.

[8] 黃江玲, 林祥偉, 邱少雄, 等. 人外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體制備的方法及成功率 [J]. 中國校醫(yī), 2015, 29(7): 526-527.

[9] 莊建龍, 王元白, 莊倩梅.外周血染色體制備方法的探討 [J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2015, 36(17): 2558-2560.

[10] 劉星, 馮昆, 張青峰, 等. 小鼠骨髓細胞中期染色體標本制備方法的改進 [J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育, 2015, 33(18): 101-102.

[11] 謝桂芬, 鐘寶花. 人外周血染色體標本制備的問題分析 [J]. 航空航天醫(yī)學雜志, 2012, 23(6): 683-685.

[12] 趙小平, 陳紹坤, 黃燕, 等. 外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體制備過程中的問題分析 [J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2009, 36(11): 2108-2109, 2112.

[13] 王喜愛, 韓林, 王平, 等. 外周血淋巴細胞染色體標本制備的質(zhì)量控制 [J]. 中國工業(yè)醫(yī)學雜志, 2009, 22(3): 228-229.

[14] 謝志威, 張晶, 李衛(wèi)凱. 外周血染色體制備改良方法的應用 [J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2013, 34(1): 82-83.

[15] 崔向青, 馬鑫, 李麗, 等. 增加中期細胞數(shù)的染色體標本制備方法研究 [J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2014, 16(7): 8-9.

[16] 趙淑娟, 龐有志, 白俊艷, 等. 禽類骨髓細胞染色體標本制備實驗方法的改進 [J]. 實驗動物科學, 2010, 27(2): 17-20.

[17] 黃燕, 趙小平, 余紅, 等. 動物骨髓細胞染色體標本制備失敗的原因分析 [J]. 生物學通報, 2006, 41(1): 52-53.