SD 大鼠腦脊液采集方法的改進(jìn)

朱奕昕，葉冬青，，李曉莉*

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南京 210009； 2.東南大學(xué)神經(jīng)精神疾病研究所，南京 210009)

腦脊液是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中經(jīng)常用到的標(biāo)本，在腦損傷機(jī)制、生物標(biāo)記物、藥物治療等研究領(lǐng)域有著不可替代的研究?jī)r(jià)值，但是由于鼠的腦室及蛛網(wǎng)膜下腔狹小，其內(nèi)血管又很豐富，導(dǎo)致了腦脊液提取過(guò)程復(fù)雜，且容易刺穿延髓致使大鼠死亡，因此腦脊液采集的低成功率成了許多研究室面臨的技術(shù)難題。本研究通過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，并在以往報(bào)道的腦脊液采集方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，為無(wú)腦脊液采集經(jīng)驗(yàn)的初學(xué)者提供了一種準(zhǔn)確、方便快速、無(wú)血污染的大鼠腦脊液收集技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，體重300～400 g，8～12周，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(滬) 2013-2016]，飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SYXK(蘇) 2013-0037]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循美國(guó)“國(guó)家衛(wèi)生研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”和“東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”相關(guān)條例。

1.2 主要試劑與儀器

腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，微量進(jìn)樣器(100 μL，上海光正醫(yī)療儀器有限公司)，水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司)，冷凍離心機(jī)(CT15RE，Hitachi KoKi日本日立公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

45只大鼠隨機(jī)分為三組，每組15只：第一組為經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取法，第二組為經(jīng)皮直接穿刺延髓池抽取法，第三組為直視下經(jīng)硬脊膜穿刺延髓池抽取法。

1.3.2 腦脊液抽取方法

7%水合氯醛腹腔麻醉大鼠。動(dòng)物麻醉后，將腦立體定位耳桿緊貼雙耳分別插入兩外耳道，固定耳桿于主框上，并使兩側(cè)耳桿讀數(shù)相同。將大鼠的上門(mén)齒鉤住門(mén)齒桿，固定上頜。將門(mén)齒桿升高，使大鼠頭部與軀體約成135°(圖1)。于大鼠頭枕部剪毛、消毒，沿后正中線切一縱行切口(約1.5～2 cm)。根據(jù)分組，將動(dòng)物進(jìn)行以下操作：(1)經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取法：打開(kāi)皮膚后，會(huì)看見(jiàn)枕骨隆凸后有一倒三角形的肌肉間隙，用微量進(jìn)樣器的針尖部抵住三角形凹陷的底部沿后正中線下滑，至枕骨大孔后進(jìn)針，針尖斜面向上，并與身體平行，即針與頭部的角度約為135°(見(jiàn)圖1 A～D)。注意進(jìn)針?biāo)俣炔灰诉^(guò)快。當(dāng)針尖透過(guò)黃韌帶時(shí)，有明顯的落空感，此時(shí)針尖即進(jìn)入延髓池(深度約0.2 mm)，停止進(jìn)針，左手固定針頭部分不動(dòng)，右手緩慢抽取腦脊液，此時(shí)應(yīng)注意抽取速度一定要慢，否則容易出現(xiàn)血性腦脊液。抽取后迅速退針，將腦脊液移入0.5 mL的EP管中，離心后于液氮或者干冰中速凍并移入-80℃冰箱保存。(2)經(jīng)皮直接穿刺延髓池抽取法[3-5]：動(dòng)物按照上述步驟麻醉固定后，大鼠頭枕部剪毛、消毒，用微量進(jìn)樣器直接經(jīng)枕骨大孔進(jìn)入延髓池緩慢抽取腦脊液；(3)直視下經(jīng)硬脊膜穿刺延髓池抽取法[2-4]：動(dòng)物按照上述步驟麻醉固定后，大鼠頭枕部消毒、鈍性分離枕部肌肉，暴露枕骨大孔后，微量進(jìn)樣器直接穿刺延髓池抽取腦脊液。

各組大鼠于腦脊液收集后，根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行其他組織取材。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

將收集到的腦脊液于20 min內(nèi)，4℃、4500 r/min、10 min離心[1]，如果腦脊液為淡紅色，表明是血性腦脊液并發(fā)生溶血，如果EP管底部有紅色沉淀，表明是血性腦脊液，但未發(fā)生溶血。出現(xiàn)血性腦脊液或未能采集到腦脊液判為采集失敗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.01 軟件處理數(shù)據(jù)。使用χ2檢驗(yàn)比較各種方法腦脊液采集成功率，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

在45只大鼠中，第一組(經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取法)共成功抽取腦脊液13只，離心后呈清亮透明狀，未出現(xiàn)紅色沉淀現(xiàn)象，一般一只大鼠可抽取80～120 μL腦脊液，體重稍大的大鼠能抽取到120～140 μL腦脊液，成功率為86.7%，有2只出現(xiàn)了血性腦脊液，但離心后仍能獲得80 μL以上的清亮腦脊液；第二組(經(jīng)皮直接穿刺延髓池抽取法)共成功抽取腦脊液7只，成功率為46.7%，有5只出現(xiàn)了血性腦脊液，3只抽取腦脊液失敗；第三組(直視下經(jīng)硬脊膜穿刺延髓池抽取法)共成功抽取腦脊液5只，且抽取量在30～60 μL之間，成功率為33.3%，另外10只未能抽取到腦脊液。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取法其成功率明顯優(yōu)于另外兩組腦脊液采取法，P=0.0093(見(jiàn)圖2、表1)。

注： 1：經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取法；2：經(jīng)皮直接穿刺延髓池抽取法；3：直視下經(jīng)硬脊膜穿刺延髓池抽取法。圖2 三組方法大鼠腦脊液采集成功率Note.The successful rate of collecting rat CSF in the group 1 (through neck muscles) is 86.7%, Group 2 (through skin directly) is 46.7%, and group 3 (through the endorhachis) is 33.3%.Fig.2 Successful collection rate of different methods for collecting CSF in the rats

3 討論

由于腦脊液成分可以間接地反應(yīng)腦組織中的情況，因此腦脊液中相關(guān)成分的分析是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到的技術(shù)。但是由于腦脊液采集方法和技術(shù)的限制，常常成為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的難題。如何能在采集充足腦脊液的情況下避免血性污染成為腦脊液抽取的關(guān)鍵。

然而，在眾多以往報(bào)道的腦脊液采集方法中，腦脊液抽取失敗或血性腦脊液的出現(xiàn)往往是困擾研究人員的關(guān)鍵問(wèn)題。特別是對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，如何能快速掌握一種快速有效的腦脊液采集方法成為制約后續(xù)研究的關(guān)鍵。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的采集腦脊液的方法主要有以下幾種：經(jīng)皮直接穿刺延髓池抽取法[3-5]、直視下經(jīng)硬脊膜穿刺延髓池抽取法[2-4]、直視下劃破硬脊膜抽取法[3-4]等。

本研究小組在既往報(bào)道的基礎(chǔ)上，將抽取方法做了調(diào)整，建立了更適合初學(xué)者的方法。該方法與直接經(jīng)皮直接抽取腦脊液的方法相比，微量進(jìn)樣器抽取的位置更容易掌握，減少了操作偏差。該方法與打開(kāi)皮膚和肌肉，直視狀態(tài)下抽取腦脊液的方法相比，由于我們只是將皮膚剪開(kāi)，避免傷及肌肉，從而減少了肌肉出血導(dǎo)致腦脊液污染的可能性。同時(shí)對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，由于不熟練而出現(xiàn)第一次進(jìn)針未能順利抽出腦脊液的情況時(shí)，由于肌肉的收縮和封閉功能，可以第二次或者第三次調(diào)整針頭方向或者位置，避免了在直視狀態(tài)下當(dāng)?shù)谝淮挝茨艹晒Τ槌瞿X脊液后，退針后腦脊液外流嚴(yán)重而不能再次抽取無(wú)污染樣本的情況。另外當(dāng)動(dòng)物需要繼續(xù)飼養(yǎng)時(shí)，只打開(kāi)皮膚經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取腦脊液方法與打開(kāi)皮膚和肌肉直視狀態(tài)下抽取法相比，其具有創(chuàng)傷范圍小，動(dòng)物恢復(fù)快等顯著優(yōu)點(diǎn)。本研究的不足之處是：由于本研究所用大鼠抽取腦脊液后均被處死取材，未探討運(yùn)用各種腦脊液采集方法后大鼠遠(yuǎn)期存活率，我們將在后期研究中補(bǔ)充該方面的研究。

綜上所述，經(jīng)過(guò)探索建立的打開(kāi)皮膚經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取腦脊液的方法具有簡(jiǎn)單、快捷、高效等優(yōu)點(diǎn)，是一種較好的采集腦脊液的方法，尤其適用于無(wú)腦脊液采集經(jīng)驗(yàn)的初學(xué)者。

表 1 各組大鼠腦脊液采集結(jié)果Tab.1 Results of collecting CSF in different groups

注：與另外兩組比較比較，**P< 0.01。

Note.Compared with other two groups,**P< 0.01.

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