靶向β-葡萄糖醛酸苷酶的抗腫瘤藥物研究進展

郭家鼎，郝 佳*

(天津中醫藥大學，天津市中藥化學與分析重點實驗室 天津300193)

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase，簡稱 βGU)是人體重要的酸性溶酶體水解酶，參與機體多種代謝過程。由于該酶的生物學特性及其在腫瘤發生發展過程中的特異性表達，因而引起學者的長期關注。本文綜述了 β-葡萄糖醛酸苷酶與腫瘤的關系及基于 β-葡萄糖醛酸苷酶的抗腫瘤藥物的研發近況。

1 βGU簡介及其與腫瘤的關系

βGU是一種酸性溶酶體酶，是由 4個相同的77,KDa大小的糖蛋白組成的四聚體結構。Glu540、Glu451及Tyr504 3個關鍵氨基酸殘基所在的區域組成了該酶的活性催化位點。其中 Glu540為親核中心，Glu451為給質子中心，Tyr504雖作用不明，但在功能上卻不可或缺[1]。βGU 是含葡萄糖醛酸苷鍵結構多糖類物質降解的關鍵酶，具有極高的催化效率，幾乎可以水解任何含 β-葡萄糖醛酸苷結構的底物。βGU對pH值的敏感性，為其在抗腫瘤靶向治療中的應用提供良好契機。

腫瘤組織中，βGU水平較正常細胞存在明顯的異常表達，且這種高表達現象在廣泛的惡性腫瘤中都有體現，如乳腺癌、肺癌、胃腸道、黑色素瘤等[2]。βGU活性最佳的pH值為4左右，與溶酶體內的pH值相仿，而在正常體液環境(pH值7.2左右)中，則僅顯示 10%,的活性[3]。有別于正常細胞的 βGU 只存在于溶酶體中，βGU在腫瘤細胞中被炎癥細胞外排到細胞外的壞死區域，而實體腫瘤中缺氧及酸性的微環境更有利于提高 βGU的活性水平。因此，異常活躍的βGU是靶向抗腫瘤研究中重要的研究靶標。

2 基于βGU的PMT藥物

圖1 基于βGU的PMT藥物實例Fig.1 Examples of PMT Drugs based on Beta-GU

前體藥物單藥治療(PRODRUG MONOTHERAPY，簡稱 PMT)是指單獨使用前體藥物，利用腫瘤微環境，將低毒前藥在腫瘤組織轉化為原藥的治療理念。由于 βGU在大多數實體腫瘤中的高水平表達，基于βGU的PMT藥物一度成為研究熱點，很多具有細胞毒性的化療藥物都進行了針對 βGU的前藥衍生。一般情況下，由于前藥分子中的葡萄糖醛酸基團增加了分子的親水性，使得細胞對藥物的被動攝取受阻，進而正常細胞中只存在于溶酶體中的 βGU無法將前藥轉化為具有細胞毒性的原藥分子，所以基于βGU的PMT藥物與原藥相比毒性都有顯著降低。與此同時，腫瘤組織的胞外就存在大量的 βGU，可以高效地將前藥分子轉化為原藥。較低的毒性加上腫瘤組織的靶向性激活使得基于 βGU的 PMT藥物具有良好的研究前景(見圖1)。

紫杉醇是治療婦科腫瘤和非小細胞肺癌臨床上常用的化療藥物，但在治療劑量下，紫杉醇存在諸如骨髓抑制和感覺神經病變等一系列不良反應。而由于其溶解性很差，需要助溶劑才能注射給藥，容易引起過敏反應。研究人員設計并合成了紫杉醇 βGU前藥(圖1中的化合物1)，其細胞毒性降低了70倍，穩定性良好，水溶性也相應有所提高，且在 βGU 存在下迅速分解并釋放原藥[4]。環杷明的 βGU前藥(圖 1中的化合物 2)細胞毒性比環杷明顯著下降，體內外活性評價表明，在無 βGU 條件下，化合物 2對正常細胞幾乎沒有表現出細胞毒性，而在大鼠移植膠質母細胞瘤動物模型上，化合物2表現出比原藥環杷明還要優良的抗腫瘤活性，用藥后腫瘤密度顯著降低[5，6]。白樺脂酸目前正作為治療黑色素瘤的化療藥物進行臨床II試驗，其βGU前藥(圖1中的化合物3)在體外試驗中同樣表現出低毒、靶向釋藥的特點，具有被進一步研究的潛力[7]。氨基喜樹堿的 9位 βGU前藥(圖 1中的化合物 4)被體內實驗證實其單獨給藥對人腫瘤裸鼠移植瘤具有良好的抗腫瘤活性，當其與抗血管生成藥單克隆抗體 DC101聯合應用時，對人結腸癌裸鼠移植瘤模型的抗腫瘤活性顯著提高，優于單獨給藥的治療效果。實驗結果證實化合物 4尤其適合針對巨噬細胞或中性粒細胞炎性細胞浸潤的腫瘤的治療[8]。微管蛋白聚合抑制劑MMAE已經被FDA批準上市治療淋巴瘤，該藥物抗腫瘤活性強，可以達到納摩爾級別，且抗癌譜廣泛，但仍存在一些不良反應和毒副作用。研究人員將其進行 βGU前藥修飾，設計并合成了前藥分子化合物5(圖1中的化合物5)。體外實驗表明，前藥 5相比原藥細胞毒性顯著降低，且在 βGU條件下能夠快速分解釋放出原藥。對于C57BL/6小鼠皮下Lewis肺癌模型的體內實驗表明，化合物5在實驗劑量下無任何毒性反應現象，小鼠耐受性良好，且抗腫瘤作用非常明顯[9]。最新的基于βGU的 PMT藥物的研究引入了血漿白蛋白結合前藥的概念(圖1中的化合物6)。含有馬來酰亞胺結構的前藥可以與血漿白蛋白結構中的氨基酸殘基Cys34中的巰醇發生偶合，從而形成一個大分子藥物轉運體。該轉運體除了可以在腫瘤組織富集以外，由于結合了血漿白蛋白，所以還具有良好的藥代動力學特征[10]。在腫瘤組織中，βGU水解糖苷鍵引發自分解反應，從而釋放原藥(見圖 2)。在小鼠 Lewis肺癌移植瘤模型上進行的活性評價表明，前藥6具有與原藥多柔比星相當的抗腫瘤活性，且小鼠幾乎沒有表現出明顯的毒副作用[11]。

圖2 基于βGU應答的阿霉素血漿蛋白結合前藥Fig.2 Antecedents of adriamycin plasma protein binding based on βGU response

盡管βGU在絕大多數實體腫瘤中都有特異性表達，但在腫瘤前期病變或者小腫瘤病變中存在表達濃度相對較低的問題，且在不同譜系腫瘤之間表達水平也存在差異。MPT前藥需要特異性表達的分子靶標種類與藥物分子匹配，同時，達到合適的濃度范圍時，才能發揮作用。故基于βGU的MPT前藥的臨床效果也受到腫瘤細胞表面特異性分子靶標，即 βGU表達異質性的限制。

3 基于βGU的ADEPT前藥系統

抗體導向酶-前藥治療(Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy，簡稱 ADEPT)是近年發展起來的頗具應用前景的腫瘤導向治療新途徑[12,13]。其可行性理論在于，首先利用腫瘤細胞表面抗原靶向性將前藥激活酶-抗體偶聯物預先富集到腫瘤組織，再給予前藥分子，前藥經酶解反應釋放原藥后，進入腫瘤細胞內發揮藥理活性。除了表達抗體的腫瘤細胞，原藥分子還可以通過旁觀者效應在鄰近未與抗體結合的腫瘤細胞內發揮藥理活性。因此，ADEPT前藥體系可以有效解決腫瘤細胞表面特異性分子靶標表達異質性的問題，彌補分子靶標類藥物在腫瘤治療中的缺陷。

前體藥物的設計理念與MPT藥物的設計理念基本相同，包含酶識別子部分、連接子部分及原藥部分。適用于 ADEPT體系的抗體-酶偶聯物是 ADEPT前藥系統有別于 MPT藥物的關鍵之處，應具有分子量小，免疫原性低，性質穩定，與抗原選擇性高，易清除等特點[14-16]，基于 βGU的抗體-酶偶聯物在實際研究中展現出良好的應用前景。

在ADEPT研究中，開展最早也是應用最多的是大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶(簡稱E．coli βGU)。將E．coli βGU與單克隆抗體RH1(簡稱MabRH1)偶聯，聯合使用化療藥物對羥基苯胺氮芥的葡萄糖醛酸苷衍生前藥(BHAMG)，可以減緩大鼠肝癌細胞生長，延長大鼠生存期。經聚乙二醇(PEG)修飾后的E．coli βGU 與MabRH1偶聯得到抗體-酶偶聯物RH1-betaG-PEG，同樣可以激活ADEPT前藥分子BHAMG，釋放原藥對羥基苯胺氮芥，在肝癌大鼠模型上表現出明顯的治愈效果[17]。E．coli βGU 與單克隆抗體Mab323/A3偶合得到的抗體-酶偶聯物可以激活表柔比星前藥Epi-Glu，進而選擇性地在腫瘤組織中釋放表柔比星。Epi-Glu比原藥表柔比星的毒性低100～1,000倍，并且在人血漿中穩定性良好，因而極大地減少了化療藥物的毒副作用[18]。非人源的抗體-酶偶合物存在自身免疫性問題，需要同步進行免疫抑制治療。隨著蛋白工程技術的發展，利用蛋白融合技術可以得到人源葡萄糖醛酸苷酶(hβGU)與抗體的抗體-酶融合蛋白，在實驗研究中展現出良好的應用前景[19-21]。目前，較為成功的融合蛋白是針對癌胚抗原CEA的Fab anti-CEA Mab BW431- hβGU蛋白[22-23]，該融合蛋白是由hβGU及針對癌胚抗原CEA的較小的單鏈抗體片段組成。在人源腫瘤移植小鼠模型上，Fab anti-CEA Mab BW431- hβGU蛋白與ADEPT前藥HMR1826聯合應用后，腫瘤組織化療藥物濃度比單獨給原藥高10倍以上，相應的其腫瘤抑制效果也優于單獨給藥組。

βGU作為靶向性抗腫瘤前藥的候選靶標具有獨特的優勢：首先，βGU在廣泛的惡性腫瘤中都有高水平表達，且βGU在腫瘤細胞中被炎癥細胞外排到細胞外的壞死區域，而正常細胞的βGU則被嚴格控制在溶酶體中；其次，正常體液環境下，βGU的活性較低，僅顯示10%,的水解活性，實體腫瘤中缺氧及酸性的微環境則更適合βGU水解活性的保持；最后，人源的βGU使得ADEPT藥物的開發減少了免疫反應，更加適用于臨床。由此可見，基于βGU的PMT藥物對于較大實體腫瘤病變具有良好的研究前景。同時，ADEPT治療系統的發展可以進一步提高腫瘤內部βGU的水平，對于前期腫瘤和小腫瘤病變具有更加完備的解決措施。綜上作述，隨著藥物研發技術的完善和發展，靶向βGU的抗腫瘤藥物將有希望真正應用到臨床實踐中。

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