甜糯雙隱基因型玉米材料的創(chuàng)制方法及鑒定技術(shù)概述

宋俏姮 孔亮亮 劉俊峰 張 垚 楊躍華

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川德陽(yáng) 618000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)鮮食玉米的品質(zhì)提出了更高的要求。為了適應(yīng)不同地區(qū)和不同人群的消費(fèi)需求，近些年我國(guó)育成了甜加糯型這一新型鮮食玉米品種。甜加糯型鮮食玉米作為一種新興的消費(fèi)食品，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。甜糯雙隱基因型玉米自交系是配制甜加糯型鮮食玉米的必備材料。在選育甜糯雙隱基因型玉米自交系的基礎(chǔ)上，通過(guò)與單（多）隱性純合體雜交組配，即可獲得甜（雜結(jié)合）糯（純結(jié)合）玉米雜交種，播種后收獲的果穗即為甜加糯型鮮食玉米（蘇彩霞 等，2013）。目前關(guān)于甜糯雙隱基因型玉米的研究仍處于摸索階段，本文對(duì)甜糯雙隱性玉米材料的創(chuàng)制方法及鑒定技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述和探討，以期解決選育甜加糯型鮮食玉米的技術(shù)瓶頸，提高育種效率和育種的預(yù)見(jiàn)性。

1 甜加糯型鮮食玉米的市場(chǎng)價(jià)值及甜糯雙隱基因型玉米材料的研究進(jìn)展

鮮食玉米是指在乳熟期采收，經(jīng)簡(jiǎn)單的加工即可食用的玉米，包括甜玉米、糯玉米、甜加糯型玉米等（滕宏飛和狄廣霞，2007），屬于主要農(nóng)作物中特殊用途的玉米類型。2016年農(nóng)業(yè)部印發(fā)的全國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整規(guī)劃中明確提出適當(dāng)發(fā)展鮮食玉米，到2020年鮮食玉米種植面積達(dá)到100萬(wàn)hm2（1 500萬(wàn)畝）。鮮食玉米風(fēng)味獨(dú)特，適口性好，富含人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活中受到越來(lái)越多的重視，消費(fèi)量和種植面積也越來(lái)越大（張勝恒 等，2004；汪黎明 等，2005）。

甜加糯型玉米是滿足“既甜又糯”消費(fèi)需求的鮮食玉米新類型，同一果穗上甜、糯籽粒隨機(jī)相間排列，入口兼具甜味與糯性，市場(chǎng)份額占比鮮食玉米市場(chǎng)1/3以上，且呈逐年上升趨勢(shì)，市場(chǎng)價(jià)值高于傳統(tǒng)的甜玉米、糯玉米20%以上，經(jīng)濟(jì)效益比普通玉米提高2～3倍（王萍 等，2016）。甜加糯型鮮食玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展尚處于起步階段，有著良好的發(fā)展前景和巨大的市場(chǎng)空間。目前玉米品種審定中，甜加糯型鮮食玉米仍作為特殊類型品種中的糯玉米組別參與審定。

甜糯雙隱性純合體是配制甜加糯型鮮食玉米必備的中間材料。玉米籽粒的甜味是由隱性純合的sh2sh2、susu、aeae等基因效應(yīng)引起的；玉米的糯性則由隱性糯質(zhì)基因waxy控制，純合wxwx基因型產(chǎn)生幾乎100%的支鏈淀粉，這種淀粉具有很強(qiáng)的糯性（劉紀(jì)麟，1991）。謝孝頤等（2003）利用糯玉米與甜玉米雜交，在F2中分離出甜糯雙隱性純合體（wxwxsh2sh2）與糯玉米回交，后代果穗同時(shí)含有糯籽粒和甜籽粒。劉紀(jì)麟（1991）報(bào)道某些雙隱性基因突變體可集中2個(gè)單隱性基因突變體各自的特點(diǎn)。吳子愷（2003）提出異隱純合體雜交法（已申請(qǐng)專利）組配甜加糯型鮮食玉米，首先培育控制玉米胚乳性狀的雙隱基因型純合體，再利用其與不同的單（多）隱性純合體雜交，使不同基因型的甜糯粒在果穗上同時(shí)存在。利用雙隱基因型純合體材料與其他不同類隱性基因型純合體材料雜交，獲得三（多）隱性純合體，根據(jù)需要通過(guò)不同隱性純合體彼此間雜交調(diào)節(jié)甜加糯型玉米果穗上的甜、糯籽粒比例，目前常用比例為1∶3、7∶9或4∶3（吳子愷 等，1997）。郝小琴和吳子愷（2003）測(cè)定了甜糯雙隱性純合體su1wx、sh2wx的農(nóng)藝性狀并分析了基因互作效應(yīng)，結(jié)果顯示純合體sh2wx的含糖量高于sh2，純合體su1wx的含糖量低于su1，純合體su1wx不能直接加以組配利用，且甜糯雙隱性純合體在實(shí)際品嘗中風(fēng)味與甜玉米類似，無(wú)糯性口感。從遺傳連鎖關(guān)系上分析，可以將甜質(zhì)基因與糯質(zhì)基因轉(zhuǎn)育到同一自交系中，獲得甜糯雙隱性純合體，且waxy表現(xiàn)出上位性效應(yīng)，waxy基因與其他甜質(zhì)基因組合的籽粒中基本為支鏈淀粉；而從基因互作的角度看，甜質(zhì)基因在糖分積累和淀粉總量上具有隱性上位作用，籽粒表現(xiàn)為甜質(zhì)，外觀和口感難以體現(xiàn)糯性（吳子愷，2003）。因此，從市場(chǎng)應(yīng)用的角度出發(fā)，甜糯雙隱性純合體只能被育種者作為中間材料加以選擇利用。

2 甜糯雙隱基因型玉米材料的創(chuàng)制方法

2.1 常規(guī)甜、糯雜交組配（以sh2sh2wxwx為例）

選取優(yōu)良糯玉米（Sh2Sh2wxwx）和優(yōu)質(zhì)超甜玉米（sh2sh2WxWx）雜交，F(xiàn)1獲得普通玉米種子（Sh2sh2Wxwx），后代植株選株自交或姊妹交，依據(jù)遺傳自由組合定律，果穗上有9/16普通玉米籽粒（Sh2_Wx_）、3/16糯 質(zhì) 籽 粒（Sh2_wxwx）、4/16甜質(zhì)籽粒，這部分甜粒需進(jìn)一步鑒定基因型（其中3/16 sh2sh2Wx_超甜玉米籽粒，1/16 sh2sh2wxwx甜糯雙隱性籽粒）（吳子愷，2003）。同時(shí)，還可以從F2中選擇3/16的糯質(zhì)籽粒播種，繼續(xù)自交，1/3的果穗表現(xiàn)全糯（Sh2Sh2wxwx），2/3的果穗分離出3/4糯質(zhì)籽粒（Sh2_wxwx），1/4表型為甜質(zhì)的雙隱性籽粒（sh2sh2wxwx）（蘇彩霞 等，2013）。選擇出的甜糯雙隱性玉米種質(zhì)連續(xù)套袋自交，進(jìn)一步純化繁殖成甜糯雙隱基因型玉米自交系（圖 1）。

圖1 常規(guī)甜、糯雜交組配甜糯雙隱基因型玉米材料

2.2 甜加糯（商品種）二環(huán)系選育法

收集和引進(jìn)國(guó)內(nèi)外優(yōu)良的甜加糯型鮮食玉米品種進(jìn)行自交，在F1果穗上選取1/4表型為甜質(zhì)的籽粒繼續(xù)自交，得到甜糯雙隱性自交系。這種甜糯雙隱性系以雜合狀態(tài)存在于甜加糯型鮮食玉米雜交種（表型為糯籽粒）中，自交1代即可分離出甜糯雙隱性純合系（徐勇 等，2009）?；蛘?，甜玉米與糯玉米雜交后的F1套袋自交，分別選出糯質(zhì)籽粒和甜質(zhì)籽粒，播種后進(jìn)行姊妹交，使之形成雙隱性基因，選取后代表型為甜質(zhì)的雙隱性籽粒播種，連續(xù)自交選擇，待性狀穩(wěn)定一致后獲得甜糯雙隱性純合自交系（盧華兵 等，2010；盧柏山 等，2016）。

3 甜糯雙隱基因型玉米材料的鑒定方法

甜糯雙隱性純合體籽粒外觀為甜質(zhì)型，在實(shí)際品嘗中，風(fēng)味和甜玉米相近，僅從外觀和口感難以判斷甜糯雙隱性玉米材料。如何快速準(zhǔn)確地鑒定甜糯雙隱基因型純合體是育種者面臨的技術(shù)難題。

3.1 測(cè)交鑒定法

測(cè)交鑒定法是目前應(yīng)用最廣泛的鑒定方法。遵循隱性基因遺傳規(guī)律，采用糯玉米作為測(cè)驗(yàn)種，通過(guò)雜交，觀察當(dāng)代種子籽粒類型，鑒別出表型均為甜質(zhì)的甜糯雙隱基因型玉米材料或甜玉米材料（劉亞利 等，2011）。糯玉米與甜糯雙隱性玉米雜交產(chǎn)生的果穗籽粒表型為糯質(zhì)，與甜玉米雜交產(chǎn)生的果穗籽粒為普通型。挑選出當(dāng)代種子籽粒類型為糯粒的雙隱性純合體，進(jìn)一步純化繁殖（圖2）。

圖2 測(cè)交鑒定甜糯雙隱基因型玉米材料

3.2 SSR分子標(biāo)記鑒定法

SSR（simple sequence repeat）即簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記，也被稱為微衛(wèi)星序列標(biāo)記（microsatellite sequence）、短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記（short tendom repeat）或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（simple sequence length porlymorphism），是以PCR技術(shù)為核心的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，通常由2～5個(gè)核苷酸組成串聯(lián)重復(fù)單位，也有少數(shù)由1～6個(gè)核苷酸為單位組成多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列（俞琦英和包斐，2010）。SSR標(biāo)記技術(shù)通過(guò)尋找與目標(biāo)基因或QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)行基因精確定位，通過(guò)與目標(biāo)基因緊密連鎖的特定分子標(biāo)記，對(duì)某特定性狀基因型跟蹤檢測(cè)，在后代群體中判斷出含有目標(biāo)基因的個(gè)體（李麗 等，2008；楊留啟和楊文鵬，2008）。

玉米糯性是淀粉修飾基因waxy發(fā)生隱性突變，籽粒胚乳中直鏈淀粉幾乎完全缺失造成的突變性狀（姚堅(jiān)強(qiáng) 等，2013）。已公布的糯玉米隱性基因（waxy）序列長(zhǎng)3 868 bp，位于玉米第9染色體。甜糯雙隱性純合體籽粒中幾乎全為支鏈淀粉，呈糯性，淀粉總量少，籽粒表型為甜質(zhì)，需借助鑒定手段判定其基因型。李新海等（2003）報(bào)道了位于9.03染色體位置，與糯玉米隱性基因（waxy）緊密連鎖的3對(duì)SSR標(biāo)記引物：phi022、phi027、phi061。楊耀迥等（2010）基于SSR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)成功鑒定出含有sh2sh2wxwx基因型的甜糯雙隱純合體玉米單株9株，經(jīng)過(guò)4代連續(xù)自交后得到穩(wěn)定的甜糯雙隱基因型玉米自交系。甜糯雙隱性純合體籽粒表型為甜質(zhì)，默認(rèn)其含有甜質(zhì)基因，利用與糯玉米隱性基因waxy緊密連鎖的SSR標(biāo)記引物，從中找出含有糯質(zhì)基因的個(gè)體，即為甜糯雙隱性玉米種質(zhì)。具體操作：首先選擇并合成與糯質(zhì)基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記引物，將供試材料播種待其長(zhǎng)至4～6葉期取材，以優(yōu)良糯玉米自交系的葉片作為對(duì)照，提取DNA，利用相應(yīng)的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳結(jié)果中與對(duì)照具有相同條帶的即為含有wxwx基因型的單株樣品，在田間對(duì)應(yīng)編號(hào)的植株即為雙隱性純合sh2sh2wxwx基因型甜糯玉米自交系單株。

4 討論與展望

4.1 不同甜糯雙隱性玉米材料創(chuàng)制方法對(duì)比

常規(guī)甜、糯雜交組配法和甜加糯（商品種）二環(huán)系選育法是目前最常用的雙隱性材料創(chuàng)制方法。常規(guī)甜糯雜交組配在F1果穗上選擇甜粒，其中有1/16的甜糯雙隱性玉米籽粒，該法所需代次較少，分離比例較高，但由于外觀難以與甜籽粒相區(qū)分，需進(jìn)一步鑒定基因型，增加工作環(huán)節(jié)。常規(guī)甜糯雜交組配在F1果穗上選擇3/16的糯質(zhì)籽粒自交，F(xiàn)2有2/3的果穗分離出1/4的甜糯雙隱性玉米籽粒，可直接選擇出甜糯雙隱性純合體，無(wú)需基因型鑒定；缺點(diǎn)是所需代次較多，分離比例僅1/32，且在F1果穗上人工挑選種皮顏色為黃色的糯質(zhì)籽粒時(shí)，外觀與分離出的普通籽粒相似，容易出現(xiàn)一定概率的誤選。甜加糯（商品種）二環(huán)系選育法在F1果穗上選取1/4表型為甜質(zhì)的籽粒即為甜糯雙隱性純合體，所需代次少，分離比例高，但是長(zhǎng)期利用二環(huán)系法選育甜糯雙隱性自交系，容易造成自交系間親緣關(guān)系交錯(cuò)，遺傳基礎(chǔ)逐漸狹窄，遺傳差異縮小，難以大幅度提高新自交系的一般配合力和特殊配合力，后續(xù)選育的雜交組合在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性方面很難有質(zhì)的飛躍（盧華兵 等，2010）。

4.2 不同甜糯雙隱性玉米材料鑒定方法對(duì)比

選育甜糯雙隱基因型玉米自交系的過(guò)程中，及時(shí)判斷材料是否為雙隱性純合體是進(jìn)行后續(xù)工作的前提。測(cè)交鑒定法是育種工作者最常采用的鑒定方法，觀察早代材料的田間表現(xiàn)情況，根據(jù)育種目標(biāo)有針對(duì)性地挑選植株進(jìn)行測(cè)交鑒定，鑒定出的甜糯雙隱性純合體進(jìn)入正常育種程序；同時(shí)可將測(cè)交鑒定與配合力測(cè)定結(jié)合，確保入選的高配合力自交系含有目標(biāo)甜糯雙隱性基因（郝德榮 等，2016），但是測(cè)交鑒定工序繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，效率低下。SSR分子標(biāo)記鑒定法利用與目標(biāo)基因（waxy）緊密連鎖的遺傳標(biāo)記對(duì)某特定性狀（糯性）基因型進(jìn)行選擇，不受組織類別、環(huán)境條件和發(fā)育階段影響，可以直接選擇玉米基因型，在后代群體中直接篩選出含有目標(biāo)基因（waxy）的個(gè)體，有效簡(jiǎn)化育種程序、降低成本，加速品種遺傳改良的進(jìn)程。但SSR分子標(biāo)記鑒定法不能脫離常規(guī)育種手段單獨(dú)使用，鑒定的準(zhǔn)確率受到標(biāo)記與基因遺傳距離、材料遺傳背景、PCR反應(yīng)條件和引物特異性等因素影響（胡丹東和趙久然，2007）。

4.3 選育甜糯雙隱性玉米自交系過(guò)程中存在的問(wèn)題與展望

部分育種工作者對(duì)甜糯雙隱性純合體和甜加糯型玉米的認(rèn)識(shí)仍存在一定程度的混淆，創(chuàng)制甜糯雙隱性自交系為配制甜加糯型鮮食玉米提供了必備的種質(zhì)資源，對(duì)加快甜加糯型鮮食玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。目前多采用工藝復(fù)雜、效率低、周期長(zhǎng)的傳統(tǒng)方法進(jìn)行選育，且雙隱性材料存在種子活力差、出苗率低、植株長(zhǎng)勢(shì)弱、抗性差、籽粒果皮較厚等問(wèn)題。在選育手段上可以嘗試結(jié)合單倍體育種技術(shù)、分子育種手段或染色體融合技術(shù)，根據(jù)育種需要選擇并創(chuàng)新不同的鑒定方法，以加快育種進(jìn)程。針對(duì)種子出苗困難，需精細(xì)整地，合理密植，配套良好的田間肥水管理，重要材料可采用育苗盤單粒育苗，必要時(shí)增加發(fā)芽試驗(yàn)，選擇最優(yōu)發(fā)芽溫度和播種深度。選擇品質(zhì)佳、高抗、廣適、配合力高的親本材料，并不斷加強(qiáng)種質(zhì)資源的挖掘引進(jìn)與材料創(chuàng)新，建立相應(yīng)的品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，以提高甜糯雙隱性玉米自交系目標(biāo)性狀改良的精準(zhǔn)性和選擇效率。

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