加工番茄細菌性斑點病抗性評價體系的建立及微生物防治菌劑篩選

郭威濤周俊國吳長柳柴阿麗李寶聚*

（1河南科技學院，河南新鄉 453000；2中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

加工番茄是普通番茄中的一種栽培類型，其番茄紅素、可溶性固形物、胡蘿卜素含量高，可深加工為番茄醬、番茄干、番茄粉等制品。目前加工番茄主要生產國為美國、法國、希臘、意大利等，美國是主要消費國家，年人均消費量為33 kg（李君明 等，2001）。近年來我國對番茄制品的需求日益增大，2014年全國加工番茄種植面積達7萬hm2。隨著加工番茄種植面積的擴大、栽培管理措施及環境條件等影響，加工番茄細菌性斑點病（Pseudomonas syringaepv. tomato）發生日趨嚴重，產量和品質受到了影響。該病害自1933年首次報道以來，在全球各地均有發生，是一種嚴重危害全世界番茄生產的重要病害之一，可造成5%～75%的產量損失（Yunis et al.，1980）。近年在我國內蒙古、甘肅、新疆等地發生，主要為害葉片、果實和莖稈（王曉輝 等，2006；李志棟，2010；柴阿麗 等，2014）。

選育抗病品種是一種高效且環保的防治番茄細菌性斑點病的方法，篩選適宜的番茄細菌性斑點病人工接種鑒定方法是抗病品種選育的基礎（趙廷昌等，2000；張國麗 等，2011）。本試驗采用噴霧法、涂抹法、灌根法、葉腋針刺法和莖上針刺法等5種接種方法對209份醋栗番茄品種進行番茄細菌性斑點病的抗性評價，以期建立加工番茄細菌性斑點病抗性鑒定技術，并在此基礎上篩選出抗細菌性斑點病的醋栗番茄品種資源。

近年來，番茄細菌性斑點病的防治主要以化學藥劑防治為主，由于菜農長期單一使用同一種藥劑，病菌易出現抗藥性，防治效果下降，菜農在生產中超濃度、超劑量濫用農藥的現象時有發生，造成藥害和蔬菜、土壤農藥殘留超標，并對環境造成污染，導致蔬菜質量和安全性的下降。隨著可持續農業發展戰略的實施，使用微生物菌劑及其復配制劑防治細菌性斑點病是今后的主要發展方向（楊春泉，2008；范廣華 等，2011）。本試驗選用23種微生物菌劑進行室內盆栽藥效試驗，篩選出對番茄細菌性斑點病有效的微生物菌劑，以期為微生物菌劑對番茄細菌性斑點病的預防、治療和推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：加工番茄細菌性斑點病菌丁香假單孢番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.tomato）具有強致病性的菌株，編號FQ13080301，保存于中國農業科學院蔬菜花卉研究所蔬菜綜合防治課題組。

供試培養基為營養瓊脂培養基（nutrient agar，NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0；營養肉湯培養基（nutrient broth，NB）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉 3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.0。NA固體培養基用于病原細菌單菌落劃線，獲得菌株純培養；NB液體培養基用于病原細菌擴繁，制備接種菌懸液。

供試番茄品種為209份醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）種質資源材料，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所加工番茄課題組提供。

供試藥劑為23種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）微生物菌劑，含活芽孢200億個·g-1，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所篩選制備。60%溴硝醇可濕性粉劑購自遼寧省丹東市農藥總廠，20%葉枯唑可濕性粉劑購自山東利邦農化有限公司，30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑購自陜西美邦農藥有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種體制備 將保存的番茄細菌性斑點病菌菌株從4 ℃冰箱試管內取出，使用已滅菌的接種環挑取單菌落，于NA固體培養基上進行劃線，然后置于細菌培養箱中28 ℃培養24 h，當培養基上出現單菌落時挑取單菌落，轉移到NB液體培養基中，28 ℃下260 r·min-1振蕩培養24 h，用無菌水配制成濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，備用。

1.2.2 不同接種方法比較 待醋栗番茄幼苗長至3～4片真葉，使用上述制備好的濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，分別采用噴霧、涂抹、葉腋針刺、莖上針刺、灌根等5種方法進行接種。具體接種方法如下。

噴霧接種法：即用小型噴霧器將接種菌懸液均勻地噴霧到每片葉片的正反面，以不形成水滴流淌為度，以噴霧清水接種為對照（趙廷昌 等，2001）。

涂抹接種法：用毛筆蘸取菌懸液涂抹于葉片正反面，每株苗涂抹4片真葉并做好標記，套袋保濕24 h（李志棟，2010），以涂抹清水接種為對照。

葉腋針刺接種法：用注射器吸取菌懸液針刺接種到植株葉腋處，每株苗注射3個葉腋處（劉秋 等，2002），以注射清水接種為對照。

莖上針刺接種法：用注射器吸取菌懸液針刺接種到主莖上，從下至上每隔1 cm進行針刺，共針刺3處，以針刺清水接種為對照。

灌根接種法：在每株幼苗根部灌入50 mL菌懸液，以灌入清水接種為對照。

每種接種方法3次重復，每次重復20株。接種后將植株置于鑒定室內保濕（RH為90%～100%）48 h，以后每天白天光照12～14 h，晚上繼續保濕（RH為80%～90%）。接種期內溫度控制在白天26～28 ℃，晚上20～22 ℃，土壤濕度85%～90%。接種7 d后進行發病情況調查。

1.2.3 醋栗番茄品種對細菌性斑點病的抗性鑒定

醋栗番茄幼苗長至3～4片真葉期采用噴霧法接種209份醋栗番茄品種，以感病品種石番15號為對照。待對照發病后進行病情分級調查。

1.2.4 醋栗番茄細菌性斑點病病情分級及抗性評價標準 噴霧法和涂抹法接種，病情分級標準：0級，葉片上無病斑；1級，0＜病斑面積≤5%；3級，5%＜病斑面積≤10%；5級，10%＜病斑面積≤25%；7級，25%＜病斑面積≤50%；9級，50%＜病斑面積≤100%（楊春泉，2008；韓盛 等，2010）。

噴霧法和涂抹法接種病情指數計算：

葉腋針刺法和莖上針刺法接種，病情分級標準：0級，無病斑；1級，植株輕度萎蔫，病斑≤0.5 cm；2級，植株50%葉片萎蔫，0.5 cm＜病斑≤1 cm；3級，除新葉外的其余葉片萎蔫，1 cm＜病斑≤2 cm；4級，葉片嚴重萎蔫，植株腐爛死亡。

灌根法接種，病情分級標準：0級，未出現葉片萎蔫或莖壞死；1級，葉片輕度變黃或萎蔫；2級，葉片中度萎蔫或莖輕度壞死；3級，葉片嚴重萎蔫或莖嚴重壞死；4級，植株死亡。

葉腋針刺法、莖上針刺法和灌根法接種病情指數計算：

抗性評價標準：免疫（I），病情指數為0；抗病（R），0＜病情指數≤20；中抗（MR），20＜病情指數≤40；感病（S），40＜病情指數≤60；高感（HS），病情指數＞60。

1.2.5 微生物菌劑對醋栗番茄細菌性斑點病的預防和治療效果評價 預防效果評價：于醋栗番茄幼苗3～4片真葉期，先噴霧微生物菌劑（含活芽孢0.2億個·g-1），對照藥劑為20%葉枯唑可濕性粉劑500倍液、60%溴硝醇可濕性粉劑800倍液、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（1 080 g·hm-2）。間隔24 h后采用噴霧法接種細菌性斑點病菌。接種后放置于保濕柜里25～28 ℃下進行常規管理，待清水對照發病后調查病情指數，并計算防效。

治療效果評價：于醋栗番茄幼苗3～4片真葉期，先采用噴霧法接種細菌性斑點病菌，置于保濕柜中保濕處理。接種24 h后，噴霧微生物菌劑（含活芽孢0.2億個·g-1），對照藥劑為20%葉枯唑可濕性粉劑500倍液、60%溴硝醇可濕性粉劑800倍液、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（1 080 g·hm-2）。待清水對照發病后調查病情指數，并計算防效。

1.3 數據處理

采用Microsoft 2010軟件和SPSS 17.0統計軟件處理試驗數據，利用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 番茄細菌性斑點病不同接種方法比較

由表1和圖1可以看出，采用噴霧法和涂抹法進行接種，番茄細菌性斑點病發病率高達100.00%，接種3 d后表現癥狀；灌根法、莖上針刺法和葉腋針刺法接種的發病率分別為73.33%、86.67%和76.67%，潛育期為4～5 d。5種接種方法中，采用噴霧法、莖上針刺法接種的平均病情指數都高于65，顯著高于葉腋針刺法，且二者的植株發病率均高于80%，但莖上針刺法的植株發病率低于噴霧法，且操作較復雜。綜合盆栽試驗結果，噴霧法是加工番茄細菌性斑點病抗性鑒定技術的最佳接種方法，簡單有效，適用于種質資源材料的抗性鑒定。

表1 番茄細菌性斑點病不同接種方法比較

圖1 番茄細菌性斑點病不同接種方法的發病情況

表2 209份醋栗番茄品種細菌性斑點病抗性鑒定結果

表3 23種新型生物殺細菌劑對加工番茄細菌性斑點病的防治效果

2.2 醋栗番茄品種對細菌性斑點病的抗性鑒定

采用噴霧法接種209份醋栗番茄品種，接種3 d后葉片上產生深褐色至黑色不規則斑點，斑點周圍有時會出現黃色暈圈。接種7 d后調查番茄細菌性斑點病發病情況，209份醋栗番茄品種均發病，但發病程度有差異（表2），其中中抗品種22份，感病品種57份，高感品種130份，未發現免疫和抗病品種，對照石番15號的病情指數＞90，屬高感品種。

2.3 微生物菌劑對細菌性斑點病的防治效果

從表3可以看出，在對番茄細菌性斑點病的預防效果上，3種微生物菌劑芽孢IVF 018號、芽孢IVF 002號和芽孢IVF 021號防效最佳，防效分別為100.00%、97.50%和82.50%；芽孢IVF 004號和芽孢IVF 020號的防效也達到或超過60%。在治療效果上，微生物菌劑IVF 018號和IVF 021號的防效最佳，防效分別為71.25%和61.67%；芽孢IVF 035號和芽孢IVF 024號的防效也達到或超過50%。

試驗結果表明，芽孢IVF 018號菌劑和IVF 021號菌劑的預防和治療效果較好，且預防效果明顯高于治療效果，可作為防治番茄細菌性斑點病的備選藥劑。

3 結論與討論

番茄細菌性斑點病由丁香假單胞番茄致病變種侵染引起，在番茄幼苗期至收獲期都可以發生，為害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實（趙廷昌 等，2001），該病害一旦發生，傳播速度很快，嚴重影響加工番茄的產量和品質，給生產帶來一定的經濟損失。

番茄細菌性斑點病菌可以侵染番茄葉片、葉柄和莖稈，病原菌可以在土壤中存活至少7個月（Blancard，2012），成為翌年初侵染源，根據病害癥狀和初侵染源，筆者選擇了噴霧法、涂抹法、葉腋針刺法、莖上針刺法和灌根法進行接種。其中，噴霧法、涂抹法和葉腋針刺法的操作方法和發病癥狀與已報道方法相同（趙廷昌 等，2000；楊春泉，2008；李志棟，2010）。而灌根法和莖上針刺接種法尚未見報道，筆者采用這兩種方法接種后，發病植株分別表現為莖段和莖基部變黑褐色，與田間自然發病癥狀相同。本試驗采用5種方法接種后，加工番茄植株都表現出相應癥狀，發病率均在70%以上，后續應用中可以根據不同的需求選擇不同的接種方法。在品種抗病性評價和生物菌劑篩選中，選擇應用噴霧法，接種后發病率為100%，平均病情指數66.56，且操作簡單，發病均勻。

醋栗番茄是番茄的野生種，與其他野生種相比，醋栗番茄與栽培番茄（S. lycopersicum）的親緣關系最近（Grandillo et al.，2011），可與栽培種直接雜交，而且具有抗生物脅迫和非生物脅迫的特性。國內外學者已從醋栗番茄品種中鑒定出多個抗真菌和細菌病害的基因，其中抗真菌病害的基因包括高抗枯萎病的I基因和I2基因（Stall & Walter，1965）， 抗 灰 葉 斑 病 的Sm基 因（Bashi et al.，1973），抗晚疫病的Ph-1、Ph-2、Ph-3和Ph-5基因（Chunwongse et al.，2002；Merk et al.，2012）；抗細菌病害的基因包括抗細菌性斑點病的pto、pti和prf基 因（Pitblado et al.，1984；Stockinger &Walling，1994），抗細菌性瘡痂病的Rx-4基因（Robbins et al.，2009）等。鑒于醋栗番茄抗性資源易于轉育和利用，筆者對209份醋栗番茄品種進行細菌性斑點病抗性評價篩選，鑒定出中抗品種22份，占鑒定總數的10.52%，感病品種57份，占鑒定總數的27.27%，高感品種130份，占鑒定總數的62.20%。雖然本試驗沒有獲得抗性種質資源，但是積累的方法可以為以后抗性資源鑒定提供技術支持。

加工番茄細菌性斑點病傳播侵染速度快，一旦發生很難防治。目前以使用化學農藥防治為主，生產中常用的藥劑有氫氧化銅、噻菌靈、噻唑鋅、中生菌素等（趙廷昌 等，2004；李寶聚 等，2008）。由于防治藥劑單一，種植戶缺乏用藥安全意識，存在過量濫用農藥的現象，導致病原菌產生抗藥性，造成對環境的極大破壞。隨著人們環境保護意識的提高，使用新型微生物菌劑為主的防治措施研究應用漸多（王文橋 等，2011；路粉和王文橋，2017）。芽孢桿菌（Bacillussp.）是目前生防細菌中研究較多的一類，因其能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子，是理想的生防菌篩選對象（Emmert & Handelsman，1999；Ye et al.，2013）。本試驗從23種微生物菌劑中篩選出對加工番茄細菌性斑點病預防和治療效果最佳的芽孢IVF 018號、芽孢IVF 021號菌劑，預防和治療效果分別達到100.00%、82.50%和71.25%、61.67%，預防效果高于治療效果，說明田間防治應以預防為主。微生物菌劑防治番茄細菌性斑點病具有環保、安全、成本低、控制效果顯著、持效期長等特點，既能有效控制該病害的發生及為害，又能避免化學農藥對生態環境和蔬菜產品的污染（魏春妹和張春明，1994；董艷 等，2015）。本試驗篩選出的微生物菌劑芽孢IVF 018號和芽孢IVF 021號，有望成為加工番茄細菌性病害防治的高效菌劑。

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