一株豬源屎腸球菌的分離鑒定及系統進化分析

韓明渠，李富偉，吳培均

（北京科為博生物技術研究院，北京 100086）

抗生素作為飼料添加劑在畜禽動物防病、抗病以及促生長等方面效果顯著，為集約化畜牧業的發展做出重大貢獻[1]。但是，人們發現抗生素飼料添加劑在帶來巨大經濟效益的同時，也造成了很大的危害，長期濫用抗生素引起病原菌產生耐藥性、二重感染、破壞動物體內微生態平衡及降低動物免疫功能等，這些都對養殖業、飼料工業和動物帶來嚴重威脅。近年來，飼用抗生素替代品的種類較多，主要有微生態制劑、酶制劑、寡糖、植物提取物、糖萜素、酸化劑等[2]。其中，微生態制劑以其無殘留、無耐藥性、無毒副作用以及效果顯著、成本低等優點而日益受到重視。微生態制劑在促進腸道內有益菌的代謝與繁殖、維持腸道微生態平衡、提高宿主動物免疫力、改善飼料利用率和生產繁殖能力以及改善環境污染等方面都有較強的效果[3]。

2013年我國農業部發布的《飼料添加劑品種目錄》中允許添加的飼用微生物有34種，其中以乳酸菌為主，包括屎腸球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等22種乳酸菌，還有芽孢桿菌、酵母菌及真菌。乳酸菌作為最早的飼用微生物添加劑菌種，已廣泛應用于畜禽、水產養殖等各個領域。屎腸球菌具有生長速度快，有較好的黏附能力，可產生乳酸和一些抗菌物質[4]。1989年，美國聯邦食品和藥物管理局（FDA）和美國飼料控制官員協會（AAF?CO）就將屎腸球菌列為可直接添加于動物飼料的菌種之一，加之其兼性厭氧的生理特性，使其與厭氧培養保存條件苛刻的其他乳酸菌相比，更適合于生產和應用。本試驗從健康豬腸道及其內容物樣品中，分離獲得了一株乳酸菌CE001，采用形態學、生理生化及分子生物學相結合的多相分類鑒定技術，將該菌株初步鑒定為屎腸球菌。

1 試驗材料

1.1 樣品

豬腸道及內容物樣品采自于北京資源肉制品廠屠宰流水線。

1.2 培養基

MRS液體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 L（pH 6.8，121℃滅菌20 min）。

固體篩選培養基：MRS液體培養基+1.5%（w/v）瓊脂+1%輕質碳酸鈣。

2 試驗方法

2.1 菌種分離與純化

2.1.1 菌種分離

采用10倍梯度稀釋法對樣品進行稀釋，用無菌移液管準確吸取1 mL不同稀釋度的菌液，分別放入3組平行的培養皿中，然后在培養皿中倒入已融化并冷卻至約50℃的固體篩選培養基，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，37℃倒置培養48 h。

2.1.2 菌種純化

待菌落長出后，挑取鈣溶圈明顯的菌落，采用三線法接種于固體篩選培養基平板上，37℃倒置培養48 h，獲得單菌落，保存備用。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態學鑒定

對劃線純化后的菌株進行革蘭氏染色鏡檢，篩選革蘭氏陽性球菌。

2.2.2 生理生化鑒定

接觸酶、氧化酶測定及碳水化合物發酵產酸試驗方法，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[5]。

2.2.3 分子生物學鑒定

16S rRNA基因的PCR擴增與測序。按照細菌基因組DNA抽提試劑盒提取CE001菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板PCR擴增16S rRNA基因，擴增引物采用細菌通用引物27F（5'-AGAG TTT?GATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACC TT?GTTACGACTT-3'）（北京睿博興科生物技術有限公司合成）。PCR反應體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物 1 μL，TaqDNA 聚合酶 0.1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃30 s，55℃1 min，72℃90 s，共35個循環，72℃10 min延伸，擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

pheS基因的PCR擴增與測序。以基因組DNA為模板PCR擴增pheS基因，擴增引物采用pheS-21F（5'-CAYCCNGCHCGYGAYA TGC-3'）和 pheS-22R（5'-CCWARVCCRAARGCAA ARCC-3'）（北京睿博興科生物技術有限公司合成）[6]。PCR反應體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物1 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃ 1 min，46℃ 135 s，72℃ 75 s，3個循環后，95℃變性35 s，46℃75 s，72℃75 s，30個循環后72℃ 7 min，擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

基因序列測定及系統發育分析。將所得序列在GenBank數據庫中進行BLAST，然后選擇相似性較高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進行多序列同源性比對，由于序列測序結果中前后的數十個堿基的錯誤率較高等原因，可將同源性比對結果中前后差異較大的部分去除，用鄰位相連法構建系統發育樹，并進行1 000次重復的Bootstraps統計學檢驗。

3 結果與分析

3.1 形態特征

在固體篩選平板上，菌落呈灰白色，圓形、完整、不透明；革蘭氏染色呈陽性，細胞為球形，如圖1所示。

3.2 生理生化特征

接觸酶和氧化酶反應均呈陰性，碳水化合物發酵產酸試驗結果見附表。

圖1 菌株CE001菌落形態及顯微形態

附表 生理生化特征

3.3 16S rRNA基因和pheS基因序列系統進化分析

菌株CE001的16S rRNA基因測序結果在Gen?Bank中進行Blast比對分析，其序列全長為1 393 bp，與腸球菌屬的16S rRNA基因序列相似性最高。選取Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensisDKO 22T（AJ640078）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構建菌株CE001與腸球菌屬部分模式種16S rRNA基因系統發育樹見圖2。如圖2所示，菌株CE001與Enterococcus faeciumATCC 19434T（DQ411813）同 處一個進化分支，親緣關系最近。

3.4 pheS基因序列分析

菌株CE001的pheS基因測序結果在GenBank中進行Blast比對分析，其序列全長為472 bp，與腸球菌屬的pheS基因序列相似性最高。選取Lactobacillus plantarumLMG 6907T（AM087714）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構建菌株CE001與腸球菌屬部分模式種pheS基因系統發育樹見圖3。

如圖3所示，菌株CE001與Enterococcus faeciumLMG 13590T（AJ843388）同處一個進化分支，親緣關系最近。

綜合菌落形態特征、生理生化特征以及16S rRNA基因和pheS基因序列的系統發育分析結果，將菌株CE001初步鑒定為屎腸球菌，在中國普通微生物菌種保藏中心的保藏號為CGMCC9666。

圖2 16S rRNA基因序列系統發育樹

圖3 pheS基因序列系統發育樹

4 小結

細菌的鑒定方法包括以形態特征、生理生化特征為參照的經典分類法，脂肪酸指紋分析和Bio?log碳源分析等化學分類法，以及基于16SrRNA基因和持家基因的序列分析的分子生物學分類法[7-8]。其中，利用分子生物學技術根據菌株的基因進行鑒定，可以將菌株的分類地位劃分的更確切。16S rRNA基因在原核生物中高度保守性，逐漸成為細菌檢測和鑒定的一種強有力工具[9]。但是，人們發現16S rRNA基因對于相近種或同一種內的不同菌株之間的分辨率較低。研究發現編碼苯丙氨酰-tRNA合成酶α亞基的pheS基因，具有高保守性和差異性且分辨率高于16S rRNA，因而被應用于乳酸菌分子分類鑒定的研究[10]。綜合應用表型分類、化學分類和分子分類等方法，即采用多相分類鑒定技術可得出準確的鑒定結果。

本研究中分離獲得的菌株CE001，綜合菌落形態特征、生理生化特征以及16S rRNA基因和pheS基因序列的系統發育分析結果，初步鑒定為屎腸球菌，在中國普通微生物菌種保藏中心的保藏號為CGMCC9666。目前，屎腸球菌在畜牧生產上應用廣泛，在提高生產性能、降低飼料利用率、維持腸道微生物菌群平衡、提高免疫力、提高肉質品質等方面效果顯著[11-13]。本研究在建立動物源乳酸菌優良菌種高效篩選及鑒定的基礎上，下一步將對菌株的抗逆性能、產酸性能和抗菌性能等生物功能進行綜合評價，從而為微生態制劑的開發利用提供優良菌種資源。

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