內質網應激對小鼠卵巢卵泡發育的影響

黃寧，于洋

內質網是真核細胞內的重要細胞器之一，與細胞內分泌蛋白及膜蛋白的合成折疊、脂質代謝、甾體激素合成密切相關，同時作為鈣離子貯存庫，發揮細胞內鈣離子穩態維持的重要作用［1-3］。一些生理或病理情況，如低氧［4］、能量不足［5］、鈣離子濃度異常［6］以及游離脂肪酸含量過多［7］均會干擾內質網功能，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚在內質網，誘發內質網應激。為了減輕內質網應激對細胞的損傷，細胞激活未折疊蛋白質應答（UPR）可維持內質網穩態，促進細胞存活。UPR通過激活三條經典通路——PERK通路、IRE1α通路、ATF6通路，將內質網內蛋白質折疊異常的信號傳遞至細胞核、細胞質乃至整個細胞，通過減少內質網蛋白質流入負擔，增強蛋白質折疊能力，誘導錯誤折疊蛋白質的降解，從而促使內質網恢復穩態［8］。

目前，已有文獻報道內質網應激與卵巢生理功能及疾病發病密切相關，但是其具體的分子途徑尚不清楚。卵泡的生長主要表現為卵母細胞體積的增長及顆粒細胞的增殖。顆粒細胞的快速增殖需要大量蛋白質的支持，同時可能會造成局部的缺氧環境，從而誘導內質網功能異常，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚在內質網，激活內質網應激和UPR［9-10］。本研究旨在探索內質網應激在體內環境中對卵巢生理功能的調節作用，利用經典內質網應激誘導物衣霉素經腹腔注射建立小鼠卵巢內質網應激模型，通過與對照組比較UPR標志分子的表達差異，明確小鼠卵巢內質網應激激活狀態。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 實驗動物為10只C57品系雌性小鼠。所有小鼠均購自北京維通利華實驗動物中心，均為SPF級。實驗中所使用動物的操作流程均經我院倫理委員會審核批準。所有小鼠飼養于北京大學醫學部實驗動物中心，飼養溫度（23±2）℃，相對濕度為（55±10）%，SPF環境，光照時間為12h光照/12h黑暗，自由攝食飲水。動物隨機分為對照組和實驗組，對照組4只，實驗組6只。對照組每只小鼠腹腔注射150 mmol/L葡萄糖溶液溶解的二甲基亞砜（DMSO），而實驗組每只小鼠注射150 mmol/L葡萄糖溶液溶解的衣霉素。分別于0、24、48h各注射1次藥物，第3次注射后4h處死小鼠，收集小鼠卵巢。

1.2 HE染色 將收集的小鼠卵巢立即放入4%的多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟，100%、95%、90%、80%及70%的乙醇由高到低至切片入水。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數分鐘。切片放入自來水中洗去多余的蘇木精染料。70%乙醇配制的0.5%～1%鹽酸對切片分色數秒到數十秒。放入0.5%～1%氨水中30～60 s藍化。0.5%～1%伊紅染料染色2～3 min。100%、95%、90%、80%及70%的乙醇從低到高脫水，再經二甲苯使切片透明，樹膠封片。

1.3 RNA的提取及RT-qPCR實驗 采用Quick-RNA MiniPrep kit（ZYMO Research）試劑盒提取組織 RNA，使用NanoDrop分光光度計檢測提取的RNA的濃度和純度。取1 μg RNA使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。qPCR實驗采用7500 Real-Time PCR儀（Applied Biosystems）完成。以β-actin為內參照，引物序列見表1。體系為：1 μL cDNA樣品，各 1 μL 上下游引物，7 μL 水，10 μL SYBR green mix（Applied Biosystems）。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min；40個循環：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。采用2-ΔΔCT法分析結果。

Tab.1 The primer sequences used for real-time quantitative PCR表1 實時定量PCR中使用的引物序列

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠卵巢內質網應激模型的建立 與對照組相比，實驗組小鼠卵巢內質網應激相關分子HSPA5、CHOP、ATF4mRNA表達顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Expression of ER stress related genes表2 內質網應激相關分子表達情況

2.2 內質網應激對小鼠卵巢卵泡發育的影響 對照組小鼠卵巢中可以看到各期發育的卵泡，在衣霉素處理后，小鼠卵巢中卵泡數量明顯減少，只有少數極小的卵泡，見圖1。

Fig.1 HE staining showing ovaries of mice（×40）圖1 HE染色檢測小鼠卵巢變化（×40）

3 討論

卵巢是一個長期處在動態變化中的器官。成年人的卵巢，無論是其結構還是功能，都存在周期性變化的特征。卵巢既具有產生卵母細胞和維持卵母細胞分裂生長的生殖作用，也具有分泌性激素的內分泌功能，而卵泡是執行卵巢生殖和內分泌功能的基本單位，卵泡的質量和數量決定著生殖潛能和生殖周期。卵泡主要包括了最內層的卵母細胞、包裹卵母細胞的顆粒細胞以及卵泡最外層的膜細胞，其發育經歷了4個過程：即始基卵泡、次級卵泡、竇前卵泡及排卵前卵泡［11］。在卵泡發育的整個過程中，只有有限的卵泡（大約300～400個或者整體的1%）發育成熟并進行排卵，大多數卵泡在發育的各個階段逐漸退化，發生卵泡閉鎖。大量研究已經明確了下丘腦-垂體-卵巢軸在卵泡閉鎖中的重要作用［12］，但對于卵巢局部微環境及卵泡內生殖細胞體細胞對卵泡閉鎖的影響尚未完全闡明。

內質網應激誘導激活的UPR是一個集適應性應答和凋亡性應答于一體的雙重反應途徑，輕度或短暫的內質網應激通過激活三條經典通路改善內質網蛋白折疊能力，促進細胞恢復穩態，當內質網應激持續激活時，UPR會誘導激活下游凋亡通路，促使細胞凋亡以避免對整個器官的損害［13］。UPR對于改善內質網穩態，維持內質網穩態至關重要，但過度激活的內質網應激造成UPR凋亡途徑的啟動被認為參與了多種疾病的發生。

目前已有研究發現內質網應激的激活會促進顆粒細胞凋亡，顆粒細胞可能參與卵泡閉鎖過程［14］。顆粒細胞是卵泡的主要細胞成分，不僅對維持卵母細胞的生長發育至關重要，也是性激素合成的主要場所。研究發現，在卵泡閉鎖的早期階段，凋亡主要發生在顆粒細胞層，而非卵母細胞或膜細胞層，因此顆粒細胞被視為卵泡閉鎖的啟動者［15］。有實驗在羊卵巢各級卵泡顆粒細胞中檢測了內質網應激相關分子的表達情況，結果發現在羊卵巢的閉鎖卵泡和未閉鎖卵泡的顆粒細胞中均檢測到了UPR標志分子GRP78（HSPA5）的表達，而UPR中與凋亡密切相關的CHOP分子的表達僅在閉鎖卵泡的顆粒細胞中檢測到，未閉鎖卵泡中并沒有檢測到；另外，閉鎖卵泡中GRP78和CHOP的分布與閉鎖卵泡中凋亡的顆粒細胞分布一致，均位于閉鎖卵泡卵泡腔側顆粒細胞［14］。也有研究利用體外實驗探索內質網應激對顆粒細胞的影響，通過加入內質網應激誘導物衣霉素或加入無血清培養液模擬營養缺乏環境誘導顆粒細胞發生內質網應激，導致了顆粒細胞凋亡［14］，這進一步驗證了UPR在調節顆粒細胞凋亡中的重要作用。在已建立的小鼠內質網應激模型中，本研究結果顯示與對照組相比，衣霉素處理后的小鼠卵巢各期卵泡數均明顯減少，說明內質網應激明顯抑制了小鼠卵巢卵泡的發育。產生這一結果的原因可能與內質網應激激活凋亡反應途徑促進顆粒細胞凋亡的作用有關，而顆粒細胞凋亡是導致卵泡閉鎖的重要因素。此外，內質網是甾體激素合成的重要場所，雌、孕、雄激素的合成依賴于內質網和線粒體的精密配合，內質網應激的激活會造成內質網功能紊亂，不僅會破壞激素合成的局部環境，也可能干擾激素合成相關酶的表達，因此內質網應激很可能影響了性激素合成水平，從而影響了卵泡發育。

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