臨床樣本中水貂嵌杯病毒的全基因組分析

王楷宬，莊青葉，邱 源，王素春，侯廣宇

(中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032)

嵌杯病毒科(Caliciviridae)病毒粒子一般呈球形或近球形，核衣殼呈二十面體對稱，直徑27～40 nm。電鏡觀察檢查時可見病毒粒子內部的高密度區為許多明亮的相互交叉的線條，而低密度區是7個光線比較暗的凹陷，中央有1個，周圍存在6個，整體觀察構成六芒星狀的圖像，其形態如同一個具有似花邊杯狀或花萼狀，故此又稱杯狀病毒。嵌杯病毒為單股、正鏈RNA病毒，其基因組大小約為7.5 kb。嵌杯病毒與微RNA病毒非常接近，以前歸類于微RNA病毒科。目前，嵌杯病毒科分為5個屬：水皰疹病毒屬(Vesivirus)、兔病毒屬(Lagovirus)、紐布病毒屬(Nebovirus)和2個人類的嵌杯病毒屬，即諾瓦病毒屬(Norovirus)和札幌病毒屬(Sappovirus)[1]。

水貂嵌杯病毒(mink calicivirus, MCV)是在美國的一個有出血性肺炎史卻一直未確定病原的水貂養殖場首次檢測到[2]。此種普通MCV通常不表現消化道的臨床癥狀，可能表現為肺炎等呼吸道癥狀。2000年，M.Guo等報道了一種能引起水貂腸炎的嵌杯病毒，被命名為水貂腸道嵌杯病毒(mink enteric calicivirus, MEC)[3]。MEC與MCV的病毒顆粒形態沒有差別，但是這兩種病毒的RNA多聚酶基因分析卻存在較大差異。MEC的RNA多聚酶區域與人札幌病毒和豬嵌杯病毒的氨基酸相似性在64%～71%，與水皰疹病毒相似性在40%～51%，與諾瓦病毒氨基酸相似性為29%～33%。而MCV的RNA聚合酶的氨基酸序列與水皰疹病毒的相似性最高，達到58%～81%，與諾瓦病毒的相似性在43%～51%；與兔病毒屬病毒的相似性在35%～37%；與諾瓦樣病毒相似性在27%～35%。結果表明MCV與水皰疹病毒親緣關系最近，MEC 所屬的科屬同札幌病毒的親緣關系最近。

國內外對感染水貂的嵌杯病毒研究較少，我國僅徐貴財2007年在大連地區的某發病水貂養殖場檢測到該病原[4]，對病原特性和基因組特性進行研究，并報道了世界上唯一的水貂嵌杯病毒全基因組序列[5]。本文對在青島地區檢測的一株水貂感染的嵌杯病毒的基因組進行高通量測序和分析，以期深入了解我國水貂感染的嵌杯病毒的分子生物學特性。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑均購自Life technologies公司；超凈工作臺(美國Forma Scientific)；移液器(Eppendorf)；孵化器(德州誠信孵化設備有限公司)；高速臺式離心機(德國Heraeus Biofuge primoR)；PCR擴增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)。

1.2 核酸提取

自青島市某養貂場2016年春季采集的糞便樣品中檢測到水貂嵌杯病毒(Mink/China/2/2016)[6]，將該份樣品充分混勻后，經高速離心和過濾去除大分子物質和細菌，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德國)提取病毒核酸，-80 ℃保存。

1.3 高通量測序(NGS)文庫構建

提取的病毒核酸采用中國動物衛生與流行病學中心報道的方法[6]構建NGS文庫。具體方法：8 μL病毒RNA加入1 μL 100 μmol·L-1引物A15N6和2 μL無核酸酶的水進行混合，72 ℃ 5 min，然后RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min；混合物加入4 μL 5×first-strand buffer, 1 μL dNTP (100 μmol·L-1), 2 μL DTT (0.1 mol·L-1), 1 μL RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor (40 U·μL-1) 和 1 μL SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase (200 U·μL-1) (Invitrogen, USA), 25 ℃反應15 min，42 ℃反應 30 min，70 ℃ 15 min終止反應；反應產物中再加入1 μL RNase H (TaKaRa, Japan)，37 ℃反應20 min；采用DynaMagTM-2 Magnet和Agencourt?AMPure?XP Reagent (Beckman Coulter, USA)純化合成的第一鏈cDNA；純化的第一鏈cDNA中加入引物B15N6，70 ℃ 5 min；再加入1 μL Klenow fragment (5 U) (NEB, USA), 5 μL 10 × NEBuffer 2, 2 μL dNTP (100 μmol·L-1) 和 1 μL DTT (0.1 mol·L-1)，37 ℃反應30 min；最后采用1 × Phusion High-Fidelity Buffer, 10 μmol·L-1引物A30和B30(表1), 0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, USA)，進行PCR擴增。PCR產物采用E-Gel?SizeSelectTMAgarose Gel進行電泳，篩選和回收約450 bp的擴增產物作為NGS文庫。

1.4 NGS測序

將NGS文庫稀釋為26 pmol·L-1，應用Ion PGM Template OT2 400 Kit對DNA文庫進行測序前的樣品處理。處理后的樣品加至Ion 316芯片，置于PGM測序儀進行測序。

1.5 測序數據分析

NGS測序數據經質控后，采用CLC genomics workbench 8.5.1(Qiagen, Germany)將測序得到的reads參考GenBank中已發表的水貂嵌杯病毒MCV-DL/2007/CN全基因序列[5](GenBank登錄號：NC_019712)進行mapping 拼接，并分析拼接完成的基因組中的ORF，注釋后的序列提交GenBank。

1.6 基因組特性分析

采用MEGA 6.0[7]將Mink/China/2/2016的全基因與衣殼蛋白氨基酸序列分別與GenBank中嵌杯病毒科的代表毒株(表2)的全基因與衣殼蛋白氨基酸序列進行比對和進化分析，并對這些毒株的衣殼蛋白氨基酸序列之間的p-distance進行分析。同時，將Mink/China/2/2016的RdRP氨基酸序列通過BLAST比對，分析該病毒是否屬于MEC。

表1引物與引物序列

Table1Primeranditssequence

引物名稱Primername引物序列PrimersequenceA15N65'-GTGTCTCCGACTCAGNNNNNN-3'B15N65'-TGGGCAGTCGGTGATNNNNNN-3'A305'-CCA/TCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3'B305'-CCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'

表2基因比較分析所使用的嵌杯病毒毒株

Table2Thevirusesusedinthegenomecomparison

病毒名稱Virus病毒名稱縮寫Abbreviationofvirus毒株名Isolatename宿主HostGenBank登錄號GenBankaccessionnumberICTV分類ICTVclassification貓嵌杯病毒FCVUrbana貓NC_001481水皰疹病毒屬豬水皰疹病毒VESVA48豬U76874水皰疹病毒屬犬嵌杯病毒CaCV犬NC_004542水皰疹病毒屬水貂嵌杯病毒MCVMCV-DL/2007/CN水貂NC_019712水皰疹病毒屬兔出血癥病毒RHDVRHDV-FRG兔NC_001543兔病毒屬歐洲野兔綜合征病毒EBHSV兔NC_002615兔病毒屬諾如病毒Norovirus人NC_001959諾瓦病毒屬札幌病毒SapporoMc10人NC_010624札幌病毒屬豬腸道札幌病毒PESVCowden豬NC_000940札幌病毒屬紐伯里1病毒NBV牛NC_007916紐布病毒屬牛嵌杯病毒BCVKirklareli牛NC_030793紐布病毒屬鵝嵌杯病毒GCVN鵝NC_024078未分類大西洋鮭魚嵌杯病毒ASCVNordland/2011鮭魚NC_024031未分類海象嵌杯病毒WCV海象NC_004541未分類兔嵌杯病毒RCVMIC-07兔NC_011704未分類豬嵌杯病毒SCVpig/AB90/CAN豬NC_012699未分類牛腸道嵌杯病毒BECVTCG牛NC_006875未分類雞嵌杯病毒CCVRS/BR/2015雞NC_033081未分類杜蘭病毒TulaVTulanevirus猴EU391643未分類

2 結 果

2.1 基因組解析

芯片上樣率為73%，測序文庫得到質量較高的序列數據測序數據。CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到水貂嵌杯病毒中國株的全基因大小為8 427 bp，GenBank登錄號為 MF677852。Mink/China/2/2016基因組具有與其他嵌杯病毒相似的結構和基因順序，其5′端有帽子結構，與結合蛋白VPg共價結合，其3′端為聚A尾，基因組(圖1)中主要包含3個ORF。ORF1(14—5 851)編碼1 946 個氨基酸的多聚蛋白，包括AAA-like蛋白、RNA解旋酶(RNA helicase)、Walker A 模體、Walker B模體、ATP結合位點、多肽酶(peptidase)、蛋白酶(protease)和RNA依賴的RNA多聚酶(RdRP)；ORF2(5 857—7 899)編碼包含衣殼蛋白(coat protein)的681個氨基酸；ORF3編碼59個氨基酸。

圖1 Mink/China/2/2016基因組結構Fig.1 Genome structure of Mink/China/2/2016

2.2 基因組比較分析

Mink/China/2/2016與19株代表性毒株(表2)的全基因組進化分析結果見圖2，衣殼蛋白氨基酸序列的進化分析見圖3，各毒株衣殼蛋白氨基酸序列之間的p-distance進行分析結果見圖4。全基因序列進化分析與衣殼蛋白氨基酸序列進化分析結果一致，說明僅分析衣殼蛋白氨基酸序列就能夠反映嵌杯病毒的遺傳進化關系。Mink/China/2/2016與已報道全基因的1株水貂嵌杯病毒(MCV DL/2007/CN)親緣關系最近，兩株水貂嵌杯病毒與VESV、WCV、FCV、CaCV歸為同一分支。此分支各毒株衣殼蛋白氨基酸序列間的p-distance均小于0.7，該屬衣殼蛋白氨基酸序列與其他屬間的p-distance大于0.7，按照ICTV第九次病毒分類報告中嵌杯病毒科中各屬的分類標準，應將水貂嵌杯病毒與VESV、WCV、FCV、CaCV歸為水皰疹病毒屬。BLAST結果顯示，Mink/China/2/2016為MCV，其RdRP氨基酸序列與MCV較近，與MEC較遠。

同時，對表2中8種ICTV未分類的嵌杯病毒分析發現：WCV歸為水皰疹病毒屬；BECV歸為紐布病毒屬；GCV和CCV歸為一個單獨的新屬；RCV歸為兔病毒屬；ASCV、SCV和TulaV按照ICTV分類標準不屬于任一已知的屬。

▲. 水貂嵌杯病毒株Mink/China/2/2016；●. ICTV未確定屬的嵌杯病毒▲. Mink calicivirus isolate Mink/China/2/2016；●. Caliciviruses which had not classified by ICTV圖2 嵌杯病毒全基因進化分析Fig.2 Genome evolution analysis of caliciviruses

▲. 水貂嵌杯病毒中國株Mink/China/2/2016；●. ICTV未確定屬的嵌杯病毒▲. Mink calicivirus isolate Mink/China/2/2016；●. Caliciviruses which had not classified by ICTV圖3 嵌杯病毒衣殼蛋白氨基酸序列進化分析Fig.3 Capsid protein amino acid evolution analysis of caliciviruses

圖4 Mink/China/2/2016 與嵌杯病毒代表毒株衣殼蛋白氨基酸序列分析Fig.4 P-distance analysis of the capsid protein amino acid sequence of Mink/China/2/2016 and the representative caliciviruses

3 討 論

嵌杯病毒可引起包括人類、貓、豬、海洋哺乳動物、兔、野兔、牛、犬、爬行類、兩棲類和昆蟲等多個物種的呼吸道病、水皰、壞死性肝炎和胃腸炎等疾病。嵌杯病毒的感染常常持久，癥狀可能不明顯、輕微，也可能嚴重[8]。對人、豬、貓、兔和豬等動物感染的嵌杯病毒的研究報道較多，但對水貂感染的嵌杯病毒的報道國內外僅有3篇文獻對此進行描述和研究。J. F. Evermann等[2]最先從水貂分離到嵌杯病毒，并發現分離到的水貂杯狀病毒具有非常特殊的生物學特性，能夠與人O型紅細胞發生凝集，不能凝集雞、鵝、兔、豬、牛、山羊、綿羊、犬、大鼠、豚鼠的紅細胞，該生物學特性的發現是本科屬繼兔出血熱病毒之后第二個具有能夠凝集紅細胞特性的病毒。該毒株還具有廣泛的細胞嗜性、血凝特性以及感染細胞表現出來得迅速致成 CPE 現象等，對于該病毒的研究將具有非常重要的意義。之后，M. Guo等[3]又發現了能引起水貂腸炎的新型嵌杯病毒MEC，并認為MCV屬嵌杯病毒科札幌病毒屬。2011年，B. C. Yang等[5]報道了我國的一株MCV的全基因組。

為深入了解水貂嵌杯病毒的特性，本文從我國青島地區水貂養殖場檢測到一株嵌杯病毒，并采用高通量測序方法獲得該病毒的全基因，也是世界上第二個報道的MCV全基因序列。從全基因分析結果來看，在青島檢測到的毒株與2011年報道的大連株全基因序列相似性極高，都屬于水皰疹病毒屬成員。編碼的3個ORF的大小相同，僅由于氨基酸序列變化而存在微小的差異。說明MCV在我國的不同區域和不同時間的流行毒株變異非常小，若研發防控此病的疫苗將在不同地區均具適用性。

本文還對現在已發現的所有19種動物嵌杯病毒進行了遺傳進化分析，為分析8種ICTV未分類的嵌杯病毒(WCV、BECV、GCV、CCV、ASCV、SCV、RCV和TulaV)的分類地位提供基礎。根據分析結果推測，WCV和BECV分別屬于水皰疹病毒屬和紐布病毒屬。而禽源的兩種病毒GCV和CCV在進化樹上屬同一分支，且兩者衣殼蛋白氨基酸序列p-distance 小于0.7，應屬同一個屬，但與其他嵌杯病毒親緣關系較遠。ASCV、SCV和TulaV衣殼蛋白氨基酸序列p-distance均大于0.7，但在進化樹中與諾瓦病毒屬關系較近，是否可歸為諾瓦病毒有待進一步研究。

4 結 論

報道了世界上第二株水貂感染的嵌杯病毒全基因，同時對嵌杯病毒各屬的進一步分類提供基礎數據，有利于了解我國流行的水貂嵌杯病毒的特性，進一步明確其與其他嵌杯病毒的進化關系。

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