2014—2015年豫南地區豬流行性腹瀉病毒S基因變異分析

董建國，王 瑞，曲哲會，趙 瑜，劉 濤

(信陽農林學院牧醫工程學院，信陽 464000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病[1]，以排水樣糞便、嘔吐、脫水和食欲下降、精神沉郁為主要特征。對剛出生的仔豬危害最大。該病于1971年在英國首次暴發，隨后瑞士、法國、中國、日本、朝鮮和美國等國家均發生該病，呈地方流行性[2-5]。PEDV是有囊膜的RNA病毒，屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬成員。PEDV基因組全長28 kb左右，包括7個開放閱讀框，它們分別編碼四個結構蛋白(S、E、M和N)及三個非結構蛋白(pp1a、pp1ab和ORF3)。PEDV S蛋白由1 383個氨基酸組成，是最大的結構蛋白。S蛋白是糖蛋白，位于病毒粒子表面[6]。有研究表明S蛋白能夠激活宿主產生中和抗體。已經發現四個中和表位(COE：aa 499—638，SS2：aa 748—755，SS6：aa 764—771，2C10：aa 1 368—1 374)[7-9]。因此，S蛋白在PEDV遺傳演化中具有重要作用。

2010年以前，PED在中國呈散發狀態。但是，2010年以后，新的變異毒株在中國許多地區出現，導致剛出生小豬嚴重腹瀉，給我國養豬業造成巨大的經濟損失。PEDV變異毒株能夠引起1～10日齡仔豬幾乎100%的感染率和80%～100%的致死率[10-11]。河南是中國中部養豬最多的省份，但是近些年部分豬場發生PED，導致大規模的仔豬死亡。因此，本研究調查了最近河南地區不同PEDV分離株S基因的改變情況，以便進一步了解該地區PEDV的流行病學，為疾病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料

河南省各地區疑似暴發PEDV的自然發病豬，采集發病豬腸道組織及內容物，無菌處理，于-80 ℃凍存備用。

1.2 細胞和菌體

所用宿主菌E.coliDH5α感受態細胞由信陽農林學院牧醫工程學院傳染病實驗室保存并提供。

1.3 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Magen公司；反轉錄試劑盒購于Promega公司；RT-PCR相關試劑盒購自TOYOBO生物科技有限公司和Vazyme公司；DNA Marker DL2000等購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自Promega公司；EB替代染料，；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和Trans-5α感受態細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.4 引物設計與合成

根據GenBank中發布的CV777和近些年發布的PEDV變異毒株序列保守區域設計4對特異性引物，將S基因分成4個片段(S1、S2、S3、S4)進行擴增，每兩段之間有一部分重疊區域，引物由上海生工生物工程公司合成。引物信息見表1。

表1PEDVS基因擴增引物序列

Table1SequencesofamplifiedPEDVSgene

名稱Name序列(5'→3')Sequence擴增大小/bpAmplificationsizeS1FTAGTGATGTTGTGTTAGGCTTGTTG1054S1RAGGATCTGAGGAATTACTGCAAACS2FCATACTGCTTTAGGAACAAATCTT1039S2RACAACTGTCCAGAATCAGATGTATAS3FTTATTACCCTTACAAATTCTAGC1083S3RGACTAATAGCCTCTTTAACACTCTS4FGCTGAGTCTTTTAACTCTGCTAT1200S4RAGACTTCGAGACATCTTTGACA

1.5 核酸提取及目的基因反轉錄擴增

將處理的病料根據Magen公司產品試劑盒進行病毒核酸的提取，然后根據TaKaRa反轉錄試劑盒，以四個片段的下游引物進行病毒RNA的反轉錄擴增合成cDNA。運用TaKaRa高保真酶擴增S基因，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小。

1.6 基因克隆和序列分析

PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用Promega公司膠回收試劑盒對目的片段進行膠回收，然后連接到北京全式金生物有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上，經過轉化挑菌鑒定后送往測序公司進行測序。將測序正確的序列運用Lasergene的SeqMan軟件進行序列拼接，隨后用于Lasergene的Meglian軟件和Mega5.0對全長S基因進行序列比對分析和構建系統進化樹。

將所獲得的PEDVS基因核苷酸序列均上傳至GenBank。

2 結 果

2.1 S基因核苷酸序列

38株PEDV臨床樣品信息和S基因擴增片段大小見表2，S基因在GenBank中的編號為KY211038到KY211075。

表2臨床樣品信息和擴增片段大小

Table2Clinicalsampleinformationandamplificationfragmentsize

序號No.名稱Designation地區AreaGenBank登錄號AccessionNo.擴增大小/bpAmplificationsize1PDS1S平頂山PingdingshanKY21105240732PDS2S平頂山PingdingshanKY21105341613LY1S平頂山PingdingshanKY21104141614XC1S許昌XuchangKY21105441105XC2S許昌XuchangKY21105541616XX1S新鄉XinxiangKY21105641617JZ1S焦作JiaozuoKY21103841618LH1S漯河LuoheKY21103941619LH2S漯河LuoheKY211040416110ZMD2S駐馬店ZhumadianKY211066416111ZMD3S駐馬店ZhumadianKY211067416112ZMD4S駐馬店ZhumadianKY211068411013ZMD5S駐馬店ZhumadianKY211069411014ZMD7S駐馬店ZhumadianKY211070411015ZMD8S駐馬店ZhumadianKY211071411016ZMD9S駐馬店ZhumadianKY211072411017ZMD10S駐馬店ZhumadianKY211073416118ZMD11S駐馬店ZhumadianKY211074416119ZMD12S駐馬店ZhumadianKY211075416120NY1S南陽NanyangKY211042417921NY2S南陽NanyangKY211043416122NY3S南陽NanyangKY211044416123NY4S南陽NanyangKY211045411024NY5S南陽NanyangKY211046417925NY6S南陽NanyangKY211047416126NY7S南陽NanyangKY211048416127NY8S南陽NanyangKY211049411028NY9S南陽NanyangKY211050415829NY10S南陽NanyangKY211051411030XY1S信陽XinyangKY211057416131XY2S信陽XinyangKY211058416132XY3S信陽XinyangKY211059411033XY4S信陽XinyangKY211060411034XY5S信陽XinyangKY211061415835XY6S信陽XinyangKY211062416736XY7S信陽XinyangKY211063416137XY8S信陽XinyangKY211064411038XY9S信陽XinyangKY2110654110

2.2 S基因的演化分析

運用MEGA5.2軟件對S基因的氨基酸序列進行進化分析。如圖1所示，擴增的PEDVS基因片段均屬于Group2，DR13毒株和CV777毒株屬于Group1。Group2又進一步的被分為五個亞組，ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S和XY5S這幾個PEDVS基因片段與GD-1、CHGD-01親緣性較近，屬于Subgroup2；LY1S、NY1/5S、XY2S與變異毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102親緣關系近，屬于Subgroup3；擴增的S基因片段ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S和LH2S與USA Colorado 2013變異毒株親緣關系較近，屬于Subgroup4；其他擴增的S基因片段與PEDV CH ZMDZY 11有更近的親緣關系，屬于Subgroup5。

2.3 S蛋白氨基酸變異分析

為了深入了解S基因的特性，運用MegAlign軟件對所有擴增的S基因編碼的S蛋白的氨基酸序列與參考毒株進行比對分析。結果顯示：擴增的S基因片段之間核苷酸序列的相似性在96.0%～100%；編碼的氨基酸序列的相似性在94.7%～100%；擴增的S基因片段與參考毒株之間核苷酸序列的相似性為84.6%～100%；編碼的氨基酸序列的相似性為79.3%～100%。與經典毒株CV777、LZC相比，所有擴增的S基因編碼的S蛋白在第55—58氨基酸位點均有5個氨基酸的插入，在第159—160氨基酸位點有2個氨基酸的缺失。與其他分離的PEDV不同的是，NY1/5S的S蛋白在第358—363氨基酸位點有6個氨基酸的插入，XY6S的S蛋白在第393—394氨基酸位點有2個氨基酸的插入。除了經典毒株CV777與LZC，所有擴增的S基因編碼的S蛋白在第55—58氨基酸位點均有4個氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位點均有2個氨基酸的缺失。然而，擴增的XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10SS基因編碼的S蛋白在第1 362—1 366 氨基酸位點有5個氨基酸的缺失，XY3/8/9S、XC1S在第161位以及第1 362—1 366 位氨基酸位點有6個氨基酸的缺失。XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10S、XY3/8/9S與XC1的S蛋白與其他毒株相比在C端有11個氨基酸的缺失。

PEDV的S蛋白是一個含有四個中和表位的一型糖蛋白。四個中和表位：COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)與2C10(1 368—1 374 aa)。所有擴增的S基因片段的中和表位與代表毒株進行分析比對，結果顯示：氨基酸的替換主要位于COE與2C10兩個區域，中和表位SS2與SS6兩個區域相對比較保守。在中和表位COE區域，LY1S有三個位點的氨基酸突變，分別如下：562位的賴氨酸突變為天冬氨酸，607位的絲氨酸突變為甘氨酸，608位的甘氨酸突變為頡氨酸。NY1S與NY5S有兩個相同的突變，即：538位的苯丙氨酸突變為絲氨酸，608位的甘氨酸突變為頡氨酸。XY2S有四個突變，即：580位的賴氨酸突變為精氨酸，592位的丙氨酸突變為脯氨酸，607位的絲氨酸突變為天冬氨酸，608位的甘氨酸突變為絲氨酸。XC2、XX1S、LH1S與XY7S毒株有三個相同的突變，分別如下：520位的組氨酸突變為精氨酸，526位的異亮氨酸突變為蘇氨酸，583位的賴氨酸突變為天冬酰胺。JZ1S有兩個氨基酸突變，即：526位的異亮氨酸突變為蘇氨酸，583位的賴氨酸突變為天冬酰胺。在中和表位2C10區域，很多擴增的S基因編碼的S蛋白在1 371氨基酸位點或1 375氨基酸位點有一個突變。ZMD4/11S、LY1S、NY1/5S、XY2S與ZMD3S均在1 375氨基酸位點由丙氨酸突變為頡氨酸。XY3/4/8/9S、ZMD4/5S、NY4/8/10S、ZMD7/8/9S與XC1S毒株均在1 371氨基酸位點由谷氨酰胺突變為亮氨酸。然而，所有擴增的S基因編碼的S蛋白在SS2與SS6兩個中和表位沒有一個氨基酸突變。

圖1 PEDV S基因的進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PEDV S gene

3 討 論

3.1 關于PEDV S基因擴增測序

目前，PEDV在中國流行并且很多學者已經報道PEDV變異毒株正在不斷出現，經典毒株制作的PEDV弱毒疫苗可能對于新出現的PEDV變異毒株不具有完全的保護能力[12-15]。本研究中，2014年至2015年中國中部河南省各地區豬場腹瀉病料中，擴增到38株PEDV的S全基因片段并測序。將擴增的S基因與參考毒株進行遺傳演化分析。結果表明：所有擴增的S基因與新分離的變異毒株CH/ZMDZY/11、AH2012、USA Colorado 2013以及2011年后中國和美國分離的毒株親緣關系很近，均屬于Group2。遺傳演化分析結果與先前的報道相似[16-17]，證明現今在河南省境內流行的PEDV毒株為變異毒株。

3.2 關于PEDV S基因進化樹分析

另外，Group2又進一步被分為五個亞組，分別為Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3，Subgroup4和Subgroup5。擴增的ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S、XY5SS基因片段與從中國南部分離出的GD-1、CHGD-01毒株親緣相近，屬于Subgroup2。LY1S、NY1/5S和XY2S屬于Subgroup3，與中國北部、東部、中部分離的變異毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102親緣關系相近。進一步分析得出，ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S與LH2S毒株與USA Colorado 2013毒株親緣關系相近，屬于Subgroup4[18]。其他擴增的S基因片段與中國中部分離的CH ZMDZY 11毒株親緣關系相近，屬于Subgroup5[19]。這些結果表明，本次從河南省擴增的38株PEDVS基因片段經歷了不同的變異演化。

3.3 關于PEDV S蛋白氨基酸序列比對分析

對于中國PEDV野毒毒株S基因全長進行演化分析，將會有助于更好地了解中國河南省PEDV毒株的遺傳演化關系。分析結果表明：所有擴增的PEDVS基因片段都有一個共同的重要特點，即編碼的S蛋白有氨基酸的插入和缺失。擴增的38株PEDVS基因編碼的S蛋白在第55—58位氨基酸位點均有4個氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位點均有2個氨基酸的缺失，與之前的研究報道相似[20]。

3.4 關于PEDV S蛋白免疫原性分析

PEDV的S蛋白屬于Ⅰ型糖蛋白，包括四個中和表位，分別為COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)與2C10(1 368—1 374 aa)。序列比對分析結果表明，擴增的38株PEDVS基因編碼的S蛋白在中和表位SS2與SS6是保守的，未發生突變。與經典毒株CV777相比，在中和表位COE區域，XY2S、XC2、XX1S、LH1S、XY7S、LY1S 和JZ1S毒株均有氨基酸突變。在中和表位2C10區域，擴增的38株PEDVS基因中有20株編碼的S蛋白有1個氨基酸突變。另外，XC2S、XX1S、LH1S與XY7S四株與美國分離的USA Colorado 2013毒株有相似的氨基酸突變[12]。有7株與BJ-2011-1、USA Colorado 2013、CH/ZMDZY/11相似，第1 375位的丙氨酸突變為頡氨酸[7，12，20]。PEDV的S蛋白是一個位于病毒表面的糖蛋白，并且誘導宿主產生中和抗體[6，20]。這些擴增的S基因編碼的S蛋白的中和表位氨基酸的突變是否會影響機體中和抗體的產生，有待進一步的研究。

4 結 論

擴增河南地區2014—2015年采集病料中的38株豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S基因并測序。分析顯示所有PEDVS基因擴增片段與近年來中國和美國分離的變異毒株親緣關系較近；擴增的PEDVS基因編碼蛋白中存在氨基酸的插入和缺失；部分編碼蛋白序列在C端有11個氨基酸的缺失；許多編碼蛋白序列的中和表位COE和2C10區域存在氨基酸突變。

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