釀酒酵母單萜合成的研究進(jìn)展

伏貝貝 趙建志 李琛 劉新利 鮑曉明， 侯進(jìn)

（1. 齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250000；2. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250010）

萜類化合物是由異戊二烯五碳單元（C5）為基本碳骨架的一大類碳?xì)浠衔铮鶕?jù)C5單元的數(shù)量和連接方式可將其分為單萜（C10）、倍半萜（C15）、雙萜（C20）、三萜（C30）、四萜（C40）、多萜等［1］。這些化合物種類繁多，功能多樣，廣泛分布于古細(xì)菌、細(xì)菌、植物、昆蟲中。研究較多的是倍半萜以及多萜類化合物在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，倍半萜青蒿素及衍生物較早就被用于治療瘧疾［2］；二萜紫杉醇更是具有抗多種腫瘤的神奇功效［3］；四萜番茄紅素具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病的作用［4］。單萜類化合物是植物精油的主要成分，除了常用于香料及食用香精、化妝品的合成，其在醫(yī)藥、化工領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用。例如，香葉醇常被用于香料及化妝品的生產(chǎn)，也可以作為臨床抗癌藥物、單萜吲哚生物堿類化合物（Monoterpene indole alkaloids）喜樹堿、長(zhǎng)春新堿等的合成前體［5］。大部分單萜類化合物對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，故常用于抗菌劑和殺蟲劑的生產(chǎn)。近年來(lái)，單萜作為極具潛力的生物燃料，也越來(lái)越受到人們的重視。例如，香葉醇、檸檬烯和蒎烯二聚物具有較高的燃燒熱值，是航空燃料未來(lái)潛在的理想選擇［6-8］。

目前，單萜類化合物主要從植物中提取分離，但由于其產(chǎn)量低，成本高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且提取和純化比較困難，不利于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。而化學(xué)合成面臨工序繁多且分離困難等問(wèn)題，而且化學(xué)合成法很難實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜及有特定親和性和專一性的萜類化合物的合成。因此，隨著生物合成學(xué)的迅速發(fā)展，許多研究者通過(guò)基因工程、代謝工程和合成生物學(xué)手段，利用微生物合成萜類化合物，為萜類化合物的合成提供了清潔生產(chǎn)的新途徑［1］。釀酒酵母是一種最簡(jiǎn)單的模式真核生物，具有生長(zhǎng)速度快，對(duì)環(huán)境耐受性高，環(huán)境友好，遺傳操作技術(shù)成熟，且易于表達(dá)植物來(lái)源的P450單加氧酶等優(yōu)勢(shì)，是萜類化合物合成的理想的底盤細(xì)胞。目前，研究人員通過(guò)萜類合成途徑的引入和優(yōu)化、釀酒酵母前體代謝物合成的強(qiáng)化、全局代謝網(wǎng)絡(luò)工程化改造等策略，多種萜類化合物已經(jīng)在釀酒酵母中獲得了異源合成，有些化合物也獲得了接近產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)量。

1 釀酒酵母合成單萜的途徑基礎(chǔ)

所有萜類化合物都是由相應(yīng)的萜類合成酶經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)催化共同前體異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和丙烯基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）合成的。自然界中存在合成萜類前體IPP和DMAPP的兩條途徑：一條是甲基赤蘚糖途徑（Methylerythritol-4-phosphate pathway），即MEP途徑，存在于植物、大多數(shù)細(xì)菌和原生動(dòng)物體內(nèi)；另一條是甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway），即MVA 途徑［1］。除了存在于植物和少數(shù)細(xì)菌中外，還存在于古細(xì)菌和大多數(shù)的真核生物體內(nèi)［9］。目前研究較多的是MVA途徑，我們以釀酒酵母中的MVA途徑為例闡述單萜合成的途徑基礎(chǔ)。

如圖1所示，在釀酒酵母中，MVA途徑是細(xì)胞必需成分麥角固醇合成途徑的一部分，其起始反應(yīng)物為乙酰輔酶A。首先，乙酰輔酶A在乙酰乙酰輔酶A硫解酶（Acetoacetyl-CoA thiolase，Erg10）和羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase，Erg13）催化作用下形成甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMGCoA），接著HMG-CoA在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，Hmgr）催化作用下形成甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）［8］。研究表明，Hmg1是決定MVA途徑通量的關(guān)鍵限速酶。在酵母細(xì)胞中存在兩個(gè)Hmg同工酶，分別由HMG1和HMG2基因編碼。其中，有氧條件下Hmg1的酶活性占總還原活性的83%，而Hmg2僅占17%左右，且性質(zhì)不穩(wěn)定易降解［10］。甲羥戊酸接著在甲羥戊酸激酶（Mevalonate kinase，Erg12）催化作用下生成甲羥戊酸-5-磷酸，進(jìn)一步在甲羥戊酸-5-磷酸激酶（Phosphomevalonate kinase，Erg8）催化下生成甲羥戊酸-5-焦磷酸，這兩步反應(yīng)是耗能過(guò)程，可消耗兩分子ATP。最后，甲羥戊酸-5-焦磷酸在脫羧酶（Mevalonate diphosphate decarboxylase，Erg19）催化作用下形成IPP，IPP經(jīng)異戊二烯基焦磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyl diphosphate isomerase，Idi1）作用異構(gòu)化形成DMAPP［8］。在釀酒酵母中，法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl pyrophosphate synthetase，Erg20）催化一分子的IPP和一分子的DMAPP合成一分子的香葉基二磷酸（Geranyl diphosphate，GPP），即單萜類化合物的合成前體。通過(guò)相應(yīng)催化酶在GPP分子基礎(chǔ)上添加不同數(shù)量的IPP單元，形成其他萜類化合物的合成前體［11］。例如，倍半萜的前體法呢基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）、二萜的前體香葉基香葉醇焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGPP）等。而FPP是甾醇和多萜醇等物質(zhì)合成的前體物質(zhì)，甾醇是真核細(xì)胞膜重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控成分，其中麥角甾醇決定了生物膜流動(dòng)性和滲透性［5］。

圖1 釀酒酵母單萜的生物合成途徑

2 釀酒酵母合成單萜的研究現(xiàn)狀

利用代謝工程及合成生物學(xué)等方法在微生物中重構(gòu)萜類合成途徑，通過(guò)優(yōu)化合成途徑使微生物成為高效合成萜類化合物的細(xì)胞工廠，已有不少文獻(xiàn)報(bào)道。在釀酒酵母中，很多萜類的合成已取得了較大的進(jìn)展，產(chǎn)量達(dá)到了克級(jí)的水平，其中青蒿素前體紫穗槐二烯、β-胡蘿卜素的產(chǎn)量分別已經(jīng)達(dá)到40.0 g/L與2.1 g/L［12-13］。然而單萜的微生物合成發(fā)展仍然相對(duì)滯后，主要原因之一是前體GPP供給不足。不同于植物，釀酒酵母缺乏特異性的GPP合成酶，這是造成前體供給不足的主要原因。在釀酒酵母中，GPP和FPP的合成是由同一個(gè)酶法呢基焦磷酸合成酶Erg20連續(xù)催化生成的。在這一反應(yīng)過(guò)程中，GPP作為過(guò)渡中間產(chǎn)物，很少?gòu)腅rg20催化位點(diǎn)上脫離，而是作為底物直接進(jìn)行FPP的合成［14］。由于Erg20兼具GPP和FPP合成酶的雙重活性以及順序催化的特性，這就導(dǎo)致胞內(nèi)游離的前體GPP含量極低，這無(wú)疑成為構(gòu)建釀酒酵母單萜合成細(xì)胞工廠的障礙。

在植物中，單萜是由單萜合成酶催化前體GPP合成的。由于野生型的釀酒酵母中缺乏單萜合成酶，因此釀酒酵母細(xì)胞本身不具備合成單萜的能力，僅在少數(shù)葡萄酒酵母細(xì)胞內(nèi)非特異性磷酸酶的作用下產(chǎn)生極少量的萜類衍生物［15］。因此，構(gòu)建釀酒酵母單萜生物合成平臺(tái)的基本思路是：首先引入異源的單萜合成途徑；然后通過(guò)調(diào)控前體供給途徑增加前體供應(yīng)以進(jìn)一步提高單萜的合成；最后綜合途徑改造達(dá)到產(chǎn)量?jī)?yōu)化。

2.1 釀酒酵母中異源表達(dá)單萜合成途徑

在植物中，單萜由單萜合成酶催化前體GPP合成，外源單萜合成酶在釀酒酵母中功能性的表達(dá)是釀酒酵母單萜合成的重要前提。Oswald等［16］在釀酒酵母中表達(dá)了來(lái)源于Ocimum basilicum的香葉醇合成酶，得到了0.5 mg/L的香葉醇。Jongedijk等［17］在實(shí)驗(yàn)室改造后的釀酒酵母中表達(dá)了來(lái)源于Perilla frutescens的（-）-檸檬烯合成酶和來(lái)源于Citrus limon的（+）-檸檬烯合成酶，其最佳產(chǎn)量達(dá)到0.49 mg/L和0.12 mg/L。Ignea等［18］篩選出兩株高產(chǎn)甾醇的野生型和實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母，并且表達(dá)了來(lái)源于Salvia fruticosa的桉樹腦合成酶基因（SfCinS1），構(gòu)建得到的重組釀酒酵母菌株，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)桉樹腦在兩個(gè)菌株中的產(chǎn)量分別達(dá)到了20 mg/L與7.5 mg/L，并且發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)甾醇的菌株中桉樹腦產(chǎn)量高。Herrero等［15］在釀酒酵母中表達(dá)來(lái)源于Clarkia breweri的芳樟醇合酶（Linalool synthases，LIS）基因，從而引入了芳樟醇合成代謝通路，構(gòu)建出了產(chǎn)芳樟醇的重組菌株，產(chǎn)量達(dá)到18 μg/L。異源表達(dá)酶活性的高低是產(chǎn)物合成效率高低的決定性因素。在利用微生物合成單萜的研究中，目前主要通過(guò)表達(dá)和分析不同來(lái)源的單萜合成酶，通過(guò)對(duì)目的產(chǎn)物產(chǎn)量的檢測(cè)，達(dá)到篩選出高活性合成酶的目的，然后通過(guò)去除導(dǎo)肽及蛋白質(zhì)工程等策略提高酶的催化效率。

本課題組前期比較了3種不同來(lái)源的香葉醇合成酶LdGES、ObGES和VoGES，發(fā)現(xiàn)表達(dá)來(lái)源于Valeriana officinalis的香葉醇合成酶VoGES獲得了更高的香葉醇產(chǎn)量［5］。隨后，Jiang等［19］比較了包括LdGES和VoGES在內(nèi)的9種不同來(lái)源的香葉醇合成酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)來(lái)源于Catharanthus roseus的香葉醇合成酶CrGES，香葉醇產(chǎn)量最高。由于單萜合成酶合成的時(shí)候都含有一個(gè)導(dǎo)肽，這些導(dǎo)肽的作用是把新合成的單萜合成酶定位到質(zhì)體中，之后這些導(dǎo)肽就被水解掉，然后這些蛋白就進(jìn)一步加工成為有活性的酶。酵母不含有質(zhì)體，也不能水解去除這些導(dǎo)肽，所以合成的單萜合成酶的活性比較低。因此表達(dá)去除導(dǎo)肽的香葉醇合成酶會(huì)使其在酵母里有更高的活性［20-21］。Jongedijk等［17］研究表明，表達(dá)來(lái)源于P. frutescens和C. limon的檸檬烯合成酶PftLS和CltLS時(shí)，刪除導(dǎo)肽后檸檬烯的產(chǎn)量分別增加了約1.5倍和8.6倍。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)刪除導(dǎo)肽的tLdGES和tVoGES的重組菌株可產(chǎn)更高的香葉醇，香葉醇的產(chǎn)量分別增加了約7倍和3倍［5］。Jiang等［19］嘗試通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬確定來(lái)源于C. roseus的香葉醇合成酶CrGES的最佳截短位置，并比較4個(gè)不同的截短位置（S14、L28、S43和S52）發(fā)現(xiàn)，4個(gè)截短的tCrGES均都能使香葉醇的產(chǎn)量得到不同程度的提高。其中，表達(dá)tS43CrGES的菌株中香葉醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到191.61 mg/L，比對(duì)照菌株產(chǎn)量提高了43倍。為進(jìn)一步闡明導(dǎo)肽位置效應(yīng)如何影響酶活性的機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建分析發(fā)現(xiàn)，tS43CrGES蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這也說(shuō)明穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是影響酶活的重要因素。

雖然提高單萜合成酶的活性在一定程度上可提高單萜化合物的產(chǎn)量，但單純單萜合成酶的表達(dá)，僅能使微生物獲得單萜合成的能力。為了進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，還需要對(duì)微生物內(nèi)源代謝途徑進(jìn)行合理的調(diào)控優(yōu)化，提高前體的合成效率。

2.2 釀酒酵母中增加單萜前體的合成通量提高單萜產(chǎn)量

在植物中，單萜主要在質(zhì)體中合成，由單萜合成酶催化前體GPP合成單萜。而GPP由專一性GPP合成酶催化IPP和DMAPP合成。但是釀酒酵母通過(guò)MVA途徑僅能釋放很少的單萜的合成前體物質(zhì)GPP，酵母缺乏特異性的GPP合成酶，導(dǎo)致釀酒酵母中GPP的含量遠(yuǎn)低于FPP，大大限制了單萜的產(chǎn)量［14］。為了增加GPP的合成，研究人員嘗試了多種策略，包括增強(qiáng)MVA途徑的通量、動(dòng)態(tài)截流GPP下游代謝途徑以及GPP合成酶的蛋白質(zhì)工程等。

增強(qiáng)MVA途徑的通量一般通過(guò)MVA途徑中關(guān)鍵限速酶的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（Hmgr）是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵限速酶，催化HMG-CoA生成甲羥戊酸。酵母本身的Hmgr是由錨定結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域兩部分組成，其表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。Donald等［22］研究發(fā)現(xiàn)刪除Hmgr的錨定結(jié)構(gòu)域后，Hmgr的mRNA水平顯著提高，且酶活性和下游代謝產(chǎn)物鯊烯的含量也得到了明顯的增加，這說(shuō)明錨定跨膜結(jié)構(gòu)域的刪除一定程度上解除了Hmgr的調(diào)控，更利于提高M(jìn)VA途徑的通量。Keasling等［23］在釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建表達(dá)青蒿素前體青蒿二烯合成酶（ADS）基因后，通過(guò)過(guò)表達(dá)Hmgr的催化結(jié)構(gòu)域（Truncated HMG-CoA reductase，tHmgr），解除甲羥戊酸途徑中的內(nèi)源限速步驟，使倍半萜青蒿二烯產(chǎn)量提高了5倍。Liu等［24］利用同樣的方法過(guò)表達(dá)tHmgr，使得單萜香葉醇的產(chǎn)量提高到1.57 mg/L。Rico等［25］通過(guò)提高tHMG1基因表達(dá)水平，使芳樟醇產(chǎn)量從 21.92 μg/L提高至30.19 μg/L。除了Hmgr，異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（Idi1）催化 IPP和DMAPP之間的異構(gòu)化，也是實(shí)現(xiàn) GPP合成的重要步驟。該反應(yīng)雖為可逆反應(yīng)，但I(xiàn)di1表達(dá)較低，IPP的含量遠(yuǎn)高于DMAPP，通過(guò)提高Idi1的表達(dá)量改變胞內(nèi)IPP和DMAPP的比例也是實(shí)現(xiàn)重新分配GPP和FPP合成的重要步驟［5］。Ignea等［26］在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)Idi1使單萜檜烯產(chǎn)量提高了3倍。此外，Upc2是調(diào)控釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)甾醇生物合成的全局轉(zhuǎn)錄因子，研究表明其突變體Upc2-1（G888D）能夠增強(qiáng)甾醇途徑的合成［27］。基于此研究結(jié)果，我們?cè)卺劸平湍钢羞^(guò)表達(dá)Upc2-1后，香葉醇的產(chǎn)量提高了 32%［5］。

MVA合成途徑的強(qiáng)化是提高包括單萜在內(nèi)的萜類化合物合成的通用策略，然而這些策略雖然可以提高單萜的合成，但增加的代謝流大部分流向了FPP下游產(chǎn)物，而非用于單萜的合成，因此特異性GPP合成酶的引入及蛋白質(zhì)工程改造就顯得尤為重要。Ignea等［26］表達(dá)了Picea abies來(lái)源的GPP合成酶，使檜萜產(chǎn)量提高30%-40%。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在酵母中引入來(lái)源于Abies grandis、P. abies、C. roseus的去除質(zhì)體導(dǎo)肽的GPP合成酶tAgPPS2、tPaPPS2和tCrGPPS，香葉醇合成不但沒有提高，反而有所下降［5］。推測(cè)異源GPP合成酶可能難以在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)活性表達(dá)。因此，內(nèi)源FPP合成酶Erg20的蛋白質(zhì)工程改造，成為提高GPP合成的主要策略。Fischer等［14］對(duì)釀酒酵母內(nèi)源FPP合成酶Erg20進(jìn)行同源模建，發(fā)現(xiàn)第197位的賴氨酸（Lys）是關(guān)鍵活性位點(diǎn)，并對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了一系列的定點(diǎn)突變，通過(guò)香葉醇的合成作為GPP合成的檢測(cè)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Lys突變?yōu)楦拾彼幔℅ly）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、半胱氨酸（Cys）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）后，產(chǎn)量提高約10-20倍。此外，突變菌株產(chǎn)香葉醇、芳樟醇、香茅醇都有了不同程度的提高。基于Fisher等的研究，Ignea等［26］對(duì)Erg20通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)模建分析，得到了阻礙FPP合成酶的活性的關(guān)鍵位點(diǎn)F96、A99、N127，然后對(duì)其做了一系列的突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別表達(dá)突變的 Erg20（F96W）、Erg20（N127W）后，檜萜的產(chǎn)量分別提高了3.21和5.57倍。而F96W和N127W雙點(diǎn)突變使檜萜產(chǎn)量增加到10.32倍。Kühner等和 Menon等［28-29］的研究發(fā)現(xiàn)，在代謝途徑中，參與連續(xù)催化的酶的活性中心相互靠近可減少中間產(chǎn)物的釋放，有利于對(duì)底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。因此，作者前期在Erg20（F96W-N127W）和來(lái)源于V.officinalis的去除導(dǎo)肽序列的香葉醇合成酶tVoGES之間引入不同的連接肽，對(duì)Erg20WW和tVoGES做了一系列的融合發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于沒有融合的Erg20WW和tVoGES，表達(dá)融合后的tVoGES-GGGS-Erg20WW使得香葉醇的產(chǎn)量提高了1.7倍［5］。Jiang等［19］也采用相似的策略，融合Erg20（F96W-N127W）和t3CrGES后，提高了香葉醇的產(chǎn)量。Deng等［30］在釀酒酵母中表達(dá)了來(lái)源于Actinidia arguta的芳樟醇合成酶（AaLS1），然后用3個(gè)不同長(zhǎng)度的連接肽將芳樟醇合成酶（AaLS1）與法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthetase，F(xiàn)PPS）進(jìn)行融合，結(jié)果表明（GGGGS）3更有助于兩個(gè)酶酶活中心的靠近，從而促進(jìn)了芳樟醇的產(chǎn)生，相比于共表達(dá)AaLS1和FPPS的重組菌株，產(chǎn)量提高了69.7%。

2.3 減少單萜內(nèi)源性轉(zhuǎn)化提高單萜產(chǎn)量

在萜類化合物合成過(guò)程中，前體及萜類化合物本身在細(xì)胞內(nèi)的非特異性轉(zhuǎn)化或者進(jìn)一步代謝往往是造成產(chǎn)量降低的重要原因。尤其在發(fā)酵后期，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化、營(yíng)養(yǎng)成分缺乏、次級(jí)代謝反應(yīng)活躍，增大了萜類物質(zhì)發(fā)生內(nèi)源性轉(zhuǎn)化的機(jī)率。研究表明，生物體內(nèi)的GPP和FPP可以在非特異性的磷酸酶和脫氫酶作用下發(fā)生內(nèi)源性轉(zhuǎn)化，生成某些萜類化合物［31］。另外，一些萜類化合物也可在非特異性反應(yīng)的作用下異構(gòu)化，形成不同類型的同分異構(gòu)體。以單萜香葉醇為例，在芳香類植物中，香葉醇可以轉(zhuǎn)化成其他萜類化合物，賦予植物不同的怡人香氣。雖然野生型釀酒酵母合成萜類化合物的能力非常弱，但是某些葡萄酒酵母可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的水解酶或者脫氫酶非特異性的轉(zhuǎn)化萜類化合物［32-33］。在釀酒酵母中，老黃酶（Old yellow enzyme，OYE）家族是細(xì)胞響應(yīng)外源毒性物質(zhì)解毒過(guò)程中的重要酶類，可將香葉醇轉(zhuǎn)化為其同分異構(gòu)體香茅醇。Steyer等［34］在釀酒酵母的培養(yǎng)基中添加一定量的香葉醇，經(jīng)檢測(cè)除了香葉醇之外，還產(chǎn)生了香葉乙酸酯、香茅醇、橙花醇乙酸酯，并發(fā)現(xiàn)Oye2是催化將香葉醇轉(zhuǎn)化成香茅醇的主要還原酶。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中敲除OYE2，分批發(fā)酵中香葉醇產(chǎn)量提高1.7倍［31］。ATF1和ATF2編碼的乙酰基轉(zhuǎn)移酶參與了萜烯醇的乙酰化，能夠?qū)⑾闳~醇轉(zhuǎn)化成萜烯乙酸酯。添加一定量的香葉醇的條件下，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除ATF1以及ATF2，萜烯乙酸酯分別降低了31%、66%-88%［34］。基于Steyer等的研究基礎(chǔ)上，我們?cè)卺劸平湍钢星贸鼳TF1，分批發(fā)酵中香葉醇產(chǎn)量提高了1.6倍［31］。在大腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的單萜內(nèi)源性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，Zhou等［35］在大腸桿菌中構(gòu)建了香葉醇合成的重組菌株，在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，香葉醇產(chǎn)量達(dá)到最高后會(huì)發(fā)生下降，經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)香葉醇被內(nèi)源脫氫及異構(gòu)化為橙花醇、橙花醛、香葉醛。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)YjgB是參與香葉醇內(nèi)源性轉(zhuǎn)化為香葉的主要酶，與出發(fā)菌株相比，敲除YJGB的菌株，香葉醇的產(chǎn)量提高了24%。

2.4 減少單萜對(duì)細(xì)胞的毒害作用有助于增強(qiáng)微生物單萜合成效率

單萜對(duì)微生物細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性，因此常常作為抑菌劑。有研究表明，單萜對(duì)細(xì)胞造成毒性的原因可能有以下幾個(gè)方面：（1）破壞細(xì)胞膜功能，導(dǎo)致菌體死亡。Liu等［36］用致死劑量的檸檬烯脅迫釀酒酵母細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜功能受到嚴(yán)重的損傷，其流動(dòng)性降低、通透性增高以及脂肪酸的比例增加。（2）破壞細(xì)胞壁的完整性，抑制菌體生長(zhǎng)。Brennan等［37］的研究表明，檸檬烯可以改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)細(xì)胞分裂有明顯的抑制作用。他們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，麥角固醇和脂肪酸生物合成途徑相關(guān)的基因并沒有上調(diào)，而與細(xì)胞壁完整性相關(guān)的基因上調(diào)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)檸檬烯處理后的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁降解酶的敏感性增加4倍。目前對(duì)于單萜破壞細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的具體機(jī)理研究仍然不清楚。（3）誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，進(jìn)而破壞包括細(xì)胞膜在內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞器膜的功能。Bakkali等［38］研究發(fā)現(xiàn)不同單萜處理釀酒酵母能夠誘發(fā)不同種類的ROS的積累。（4）影響胞內(nèi)能量代謝。Uribe等［39］發(fā)現(xiàn)β-蒎烯能夠抑制細(xì)胞呼吸，影響了H+和K+在酵母細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，干擾線粒體膜的完整性和ATP的生成。

由以上單萜對(duì)細(xì)胞毒性的機(jī)制可以看出，當(dāng)單萜的濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，其對(duì)細(xì)胞可能會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，抑制菌體的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致菌體的死亡。因此，減少單萜對(duì)釀酒酵母的毒害作用是提高利用釀酒酵母高效生產(chǎn)單萜的重要因素。目前主要通過(guò)兩種途徑減輕單萜對(duì)細(xì)胞的毒害作用：一是提高細(xì)胞自身的單萜耐受性；二是減少單萜與細(xì)胞的接觸。2012年，Brennan等［7］的研究表明，當(dāng)檸檬烯達(dá)到60 mg/L時(shí)，釀酒酵母會(huì)停止生長(zhǎng)。2015年，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)逐步提高檸檬烯的脅迫濃度對(duì)釀酒酵母進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化經(jīng)過(guò)200次傳代培養(yǎng)，篩選獲得六株檸檬烯耐受性明顯提高的菌株，并進(jìn)行基因組全測(cè)序，分析鑒定了關(guān)鍵突變蛋白tTcb3p1-989。他們隨后對(duì)該蛋白進(jìn)行了功能性和普適性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)tTcb3p1-989能夠使進(jìn)化前的菌株對(duì)檸檬烯的耐受性提高了9倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)tTcb3p1-989對(duì)β-蒎烯、月桂烯和生物噴墨燃料混合物AMJ-700t（10%甲基異丙基苯，50%檸檬烯，40%法呢烯）的耐受性也有明顯的提高，這說(shuō)明tTcb3p1-989對(duì)提高釀酒酵母單萜耐受性具有一定的普適性［40］。

減少單萜和細(xì)胞的接觸也是緩解毒性的一種有效策略，主要包括單萜的外排和隔離兩種方式，該策略對(duì)于不同的菌具有一定的普適性。單萜主要是通過(guò)自由擴(kuò)散或者相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)從胞內(nèi)到胞外的外排。Dunlop等［41］從細(xì)菌基因組中篩選出了不同的外排泵，并將其中的43個(gè)在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌外排泵AcrAB和來(lái)源于Alcanivorax borkumensis的未鑒定的外排泵均可使大腸桿菌對(duì)檸檬烯的耐受性增加。相似的，Wang等［42］將來(lái)源于子囊菌Grosmannia clavigera的 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GcABC-G1，在釀酒酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，然后用不同單萜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)GcABC-G1明顯提高了重組酵母菌株的存活率。在大規(guī)模的微生物工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，生物反應(yīng)器中的菌體密度和產(chǎn)物濃度較高，這就大大增加了產(chǎn)物和細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)。對(duì)于具有揮發(fā)性和毒性的產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，往往采取兩相發(fā)酵的方式，即在生產(chǎn)過(guò)程中添加對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的有機(jī)溶劑，及時(shí)萃取產(chǎn)物，這種方式不但防止了產(chǎn)物揮發(fā)，而且有效的降低了目的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性。在萜類生產(chǎn)過(guò)程中，目前普遍采用的兩種比較理想的有機(jī)相，分別是十二烷和肉豆蔻酸異丙酯［17，19］。

雖然目前研究不同程度的提高了釀酒酵母對(duì)單萜的耐受性，但總體而言，單萜的毒性仍然是限制其高產(chǎn)的一個(gè)重要因素。因此，解析單萜造成毒性的關(guān)鍵機(jī)理并進(jìn)一步提高釀酒酵母的單萜耐受性，可以為通過(guò)代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效的釀酒酵母合成單萜平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。

2.5 單萜合成的產(chǎn)量總結(jié)

目前，通過(guò)代謝工程改造釀酒酵母可以實(shí)現(xiàn)多種單萜的生物合成，主要包括檸檬烯、香葉醇、芳樟醇、檜萜和桉樹腦等。另外，單萜吲哚生物堿類化合物是一類重要的臨床抗腫瘤藥物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成途徑涉及十步以上的催化反應(yīng)，尤其是特異性的P450酶參與的氧化反應(yīng)，更是該類化合物合成的關(guān)鍵。作為P450酶表達(dá)的優(yōu)良宿主細(xì)胞，在釀酒酵母中以香葉醇為前體，成功合成了單萜吲哚生物堿類化合物strictosidine［43］。表1總結(jié)了釀酒酵母中單萜合成的產(chǎn)量水平以及采取的途徑改造策略。

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，大部分單萜產(chǎn)量處于毫克級(jí)水平，說(shuō)明利用微生物生產(chǎn)單萜有著較大的提升空間，但是如何實(shí)現(xiàn)單萜的高效生物合成依然面臨諸多的挑戰(zhàn)。

表1 釀酒酵母中單萜及其衍生物的產(chǎn)量和相關(guān)的途徑改造策略

3 展望

作為極具潛力的微生物細(xì)胞工廠，釀酒酵母在合成萜類化合物研究中呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。釀酒酵母除了具有較強(qiáng)的魯棒性外，其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境更接近于植物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，更有利于表達(dá)植物來(lái)源的酶類的表達(dá)，尤其P450氧化酶等。目前，相比于倍半萜，單萜的微生物合成研究起步較晚，發(fā)展相對(duì)滯后。雖然通過(guò)各種各樣的代謝工程和合成生物學(xué)的方法，包括高活性異源酶類的直接篩選、蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)、增強(qiáng)前體合成途徑的通量以及模塊化工程等，使單萜的產(chǎn)量得到了較大的提高，但是離工業(yè)化的生產(chǎn)差距還較遠(yuǎn)，仍有許多工作需要進(jìn)一步完善。

為進(jìn)一步提高釀酒酵母中單萜的合成能力，并結(jié)合當(dāng)前研究中遇到的困難，我們認(rèn)為未來(lái)工作可重點(diǎn)從以下幾個(gè)方面開展研究：（1）采用動(dòng)態(tài)調(diào)控等策略進(jìn)一步合理弱化下游途徑。通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控，可減少代謝中間產(chǎn)物的積累，減少額外的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，從而更有利于目的產(chǎn)物的合成。例如，應(yīng)用能夠響應(yīng)代謝產(chǎn)物或者培養(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分的啟動(dòng)子，如碳源響應(yīng)的啟動(dòng)子調(diào)控代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，使菌體生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物產(chǎn)生階段有效的分離，這樣不僅避免了產(chǎn)物過(guò)早合成抑制菌體生長(zhǎng)的問(wèn)題，而且可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的集中合成，更利于碳源的有效分配。（2）加強(qiáng)前體乙酰輔酶A的合成，并增加乙酰輔酶A到MVA途徑的通量。為了提高倍半萜的產(chǎn)量，研究者深入了解乙酰輔酶A在釀酒酵母中的代謝過(guò)程，并改造其合成途徑，敲除消耗乙酰輔酶 A的反應(yīng)，使乙酰輔酶A 更多的流向細(xì)胞質(zhì)。例如，改造后的菌株使倍半萜紫穗槐二烯和α-檀香萜烯產(chǎn)量明顯提高［46-47］。而在單萜合成中，對(duì)其合成前體乙酰輔酶A的途徑改造研究設(shè)計(jì)較少。（3）通過(guò)理性的膜工程設(shè)計(jì)增強(qiáng)細(xì)胞膜的修復(fù)和再生能力，提高釀酒酵母對(duì)單萜的耐受性，構(gòu)建具備更高耐受性的釀酒酵母菌株。釀酒酵母體內(nèi)編碼磷脂和細(xì)胞膜合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在單萜脅迫條件下顯著提高，表明細(xì)胞膜修復(fù)能力對(duì)提高釀酒酵母單萜耐受性具有重要意義［48］。因此可通過(guò)改變細(xì)胞膜中磷脂比例及其分子排列方式等提高釀酒酵母的單萜耐受性。（4）通過(guò)結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬的策略對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析、采用多變量的模塊優(yōu)化技術(shù)等對(duì)參與萜類合成的途徑進(jìn)行改造，從而達(dá)到優(yōu)化代謝流向、提高單萜合成的目的。

全球資源越來(lái)越匱乏、環(huán)境惡化等問(wèn)題的日益嚴(yán)重，滿足人類對(duì)能源和健康的需求，構(gòu)建高效的微生物細(xì)胞工廠將生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成各種終端產(chǎn)品已成為必然的趨勢(shì)。隨著合成生物學(xué)的高速發(fā)展，利用合成生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)加速了細(xì)胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化，也必將縮短從設(shè)計(jì)到產(chǎn)業(yè)化的距離。隨著一些限制性因素的突破，利用微生物合成單萜的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)必將為人類的可持續(xù)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

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