黃孢原毛平革菌漆酶基因lac1680的克隆、表達及產酶研究

陳建軍 劉梁濤 曹香林

（1. 河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007；2. 河南師范大學水產學院，新鄉 453007）

我國年產秸稈總量位居世界第一，但由于缺少有效的技術手段，導致這一生物資源的嚴重浪費，同時也污染環境［1-2］。秸稈的主要成分是纖維，主要集中于細胞壁，細胞壁含量占70%以上，由纖維素、半纖維素和木質素組成；其中纖維素、半纖維素可在牛羊的瘤胃中被纖維分解菌酸解，生成揮發性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，被牛羊吸收作為能源利用［3-5］。已有研究表明這類物質的有機物消化率很低，一般牛羊很少超過50%［6］。因此要提高秸稈的吸收利用率，對木質素的降解已是重中之重。

在眾多秸稈處理的方法中，微生物降解有著獨特的優勢。木質素的完全降解是真菌、細菌、微生物群落共同作用的結果，其中真菌起著重要的作用。在降解秸稈木質素方面主要包括三類酶，漆酶（Laccase）、木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase），目前研究最多的是真菌漆酶［7］。漆酶是一種多銅氧化酶，可以氧化分解木質素中的酚類物質，近年來，對漆酶的研究也越來越多，并已經取得了顯著的結果，在環境保護、造紙、食品等行業中也變現出極大的研究價值和應用潛力［8-9］。盡管漆酶的研究已經取得一定的進展，但自然界中漆酶的產量較少，目前國內對產漆酶的菌種培養研究還處于起步階段［10］，因此利用分子生物學方法研究漆酶基因并制備表達漆酶的工程菌，對實現漆酶的大規模生產和漆酶在各行業應用具有重要的意義［11］。

漆酶在造紙、環保、能源及食品等領域極富利用價值［12］，目前漆酶的發酵主要來自于真菌，但工業化生產卻較難實現，究其原因，主要是因為易污染、酶活不穩定且活力相對較低所致［13-15］。此外，大部分真菌漆酶只有在中溫且弱酸條件下才能表現出較高的催化活性，限制了真菌漆酶在某些工業領域的應用［16-17］。因此，通過克隆性質優良的新型漆酶基因，構建高效異源表達載體及蛋白質改造等，是解決漆酶資源短缺、增強酶在較高溫度下的穩定性及在堿性條件下的高催化活性的重要途徑［18-19］。

人們對漆酶基因的克隆研究也有近百年的歷史，雖然很多學者克隆出不少漆酶基因，也都在酵母和大腸桿菌等表達體系中進行表達，但表達分泌均較弱，到現在為止并沒有可以應用于大規模生產的工程菌［20］。究其原因，可能在于未獲得酶活較高菌株作為克隆模板，表達穩定性差等［21-22］。課題組前期研究了黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium產漆酶的生化性質和生產性能。該菌株與報道過的其他菌株相比，酶活力高，降解性能較好，同時產酶的條件也好控制，為研究漆酶基因的克隆表達和漆酶的純化奠定了基礎，對構建好的工程菌產生的漆酶進行了分離純化和酶學性質研究，為后續運用蛋白質工程的方法改造酶的催化活力和穩定性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium由河南師范大學生命科學學院從菌肥中分離獲得，大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3）由本實驗保存，pET24a載體，來自上海生工公司。1.1.2 工具酶與其他試劑 限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；小提質粒試劑盒及膠回收試劑盒購自TaKaRa；卡那霉素購于Ameresco公司；IPTG購自Merck公司；丙烯酰胺（Acr）及甲叉雙丙烯酰胺（Bis）購自Promega公司；引物合成和克隆質粒測序由上海英駿生物工程公司完成；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 白腐真菌漆酶基因的克隆及序列分析 根據根據NCBI中公布的白腐真菌的漆酶的基因序列（GenBank：AY225437.1），應用 NCBI-Blast進行保守結構域分析，表明該基因有3個保守的結構域：即Cu-oxidase_3、Sufl和CuRO_2_MCO_like_1。其中Sufl是多銅氧化酶三蛋白結構域，與細胞周期調控、細胞分裂、染色體分離、無機離子轉運與代謝有關；第二個是Cu-oxidase_3的結構域，這項包含許多不同的銅氧化酶樣結構域；第3個是CuRO_2_MCO_like_1的結構域，包含未知的多銅氧化酶二蛋白結構域；根據該基因的基因組序列和PET24a表達載體的MCS位點，設計特異性PCR primers為：

其中F1中含有NdeⅠ酶切位點；R1中含有XhoⅠ酶切位點。提取黃孢原毛平革菌總DNA為模板，PCR擴增條件為94℃，5 min預變性；94℃，1 min，58℃ ；30 s，72℃，2 min；29個循環 ；72℃延伸10 min。所得片段膠回收后與克隆載體pET24a載體連接，轉化E. coliBL21（DE3），挑取陽性轉化子，提取質粒酶切鑒定后測序，測序由上海生工公司完成。

1.2.2 大腸桿菌表達載體的構建及漆酶基因的誘導表達 將克隆好的漆酶基因用NdeI和XhoI進行雙酶切，膠回收漆酶基因片段，將其與經相同酶切線性化的pET24a（+）載體連接，并將其轉化大腸桿菌E.coliBL21（DE3），篩選出陽性轉化子。酶切驗證正確后，挑選陽性轉化子接種于含50 μg/ml Kan的4 ml LB培養液的試管中，37℃ 220 r/min搖過夜并凍存；次日按1∶100接種于50 μg/ml Kan的30 mL LB培養液中，37℃ 220 r/min振搖至菌體OD600為0.4（約2 h）；取出1 mL培養物，12 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，25℃ 220 r/min振搖5 h，誘導CPE融合蛋白表達；取出1 mL培養物，12 000 ×g室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，剩余培養物4℃ 4 000×g離心12 min，棄上清，沉淀置-20℃凍存。

1.2.3 SDS-PAGE確定表達產物的分布 分別取10 μL經誘導的重組菌的上清及沉淀物，利用10%SDS-PAGE進行電泳分離，電壓130 V，考馬斯亮藍R250染色顯帶，Gel Doc2000成像系統分析。

1.2.4 漆酶融合蛋白的純化 將過夜誘導表達的菌液于12 000 r/min，4℃離心15 min，收集菌體，采用超聲波細胞破碎法，用pH7.4 PBS緩沖液懸浮菌體，經0.45 μm濾膜過濾后上柱，經Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱純化得到純化后的漆酶蛋白，收集流出液，進行12% SDS-PAGE分析。

1.2.5 表達產物的Western blotting 鑒定 收集不同誘導表達時間的表達產物100 μL，加入100 μL 2×Sample Buffer重懸，開水煮沸5 min。各取10 μL上樣進行10% SDS-PAGE電泳。然后以半干法電轉移至硝酸纖維素膜上，取下硝酸纖維素膜利用TBST緩沖液短暫漂洗后經5%光明脫脂奶粉室溫封閉l h，再用TBST漂洗3次后，與His-Tag單抗孵育過夜，次日TBST漂洗3次后，與IRDye800標記的羊抗鼠IgG孵育l h，最后TBST 3次洗膜經Odyssey紅外激光成像系統掃描實驗結果。

2 結果

2.1 漆酶基因的克隆及分析

提取黃孢原毛平革菌基因組DNA，用Lac-F1和Lac-R1引物進行擴增，連接pET24a載體后，測序得到長度為1 680 bp的基因內部片段，將其命名為lac1680（圖1）。測得擴增獲得的基因lac1680核苷酸序列與GenBank公布的漆酶基因的全基因組核苷酸序列（GenBank：AY225437.1）同源性達98%。

2.2 質粒圖譜的構建

根據載體序列和lac基因的序列最終構建成完整的全質粒圖譜，lac基因通過NdeI和XhoI兩個酶切位點插入到PET24a-lac里面全質粒圖譜如圖2所示。

2.3 重組表達質粒雙酶切

提取質粒后，用NdeI和XhoI進行雙酶切。如圖3所示，在2號泳道出現1 600 bp左右和5 000 bp左右的片段，其中較小條帶與目的條帶相似，較大條帶為質粒載體，說明表達載體連接成功。

2.4 重組菌預表達的全菌裂解物SDS-PAGE檢測

將重組質粒轉化至大腸桿菌進行誘導表達，結果如圖4 所示，經IPTG誘導的泳道出現了一條大小約75 kD的蛋白條帶，而未誘導的沒有條帶，進而說明誘導表達成功。

2.5 SDS-PAGE檢測純化的lac-c-His6蛋白

通過SDS-PAGE檢測純化后的蛋白，結果如圖5所示，4號泳道明顯呈現出一條與目的蛋白大小一致的單一蛋白條帶，幾乎看不到任何雜帶，說明純化效果良好。

2.6 Western blotting驗證lac-c-His6蛋白

利用Western blotting技術，進一步驗證漆酶蛋白的可靠性。結果如圖6所示，4號未經誘導的菌株在目的位置沒有條帶；相反，無論洗脫純化后還是濃縮后的溶液中均出現了目的條帶，從而證明該條帶即為誘導純化后的漆酶蛋白。

2.7 野生型菌株與工程菌產漆酶能力研究

圖1 漆酶基因核苷酸序列以及推導的氨基序列

圖2 pET24a質粒圖譜

圖3 pET24a-lac重組表達質粒雙酶切驗證的瓊脂糖凝膠電泳

為了解重組菌的產酶活力，以野生型黃孢原毛平革菌為對照，比較了不同時間兩株菌的產酶活力。結果顯示，二者酶活力都是隨著培養時間的增加而增加，其中野生菌株菌株在第6天達到最大值（圖7-A），構建好的工程菌株活力在第48 小時即可達到最大值（圖7-B），產酶時間大大縮短。此外，收集了菌株產酶能力最高時的細胞懸液，經細胞破碎后，通過SDS-PAGE分析表明，構建好的工程菌在蛋白水平上比原野生型菌株有了明顯的提高，而且其酶活力比野生菌株提高了近39%。

3 討論

圖4 pET24a-lac-BL21（DE3）重組菌預表達的全菌裂解物SDS-PAGE檢測

圖5 SDS-PAGE檢測純化的lac-c-His6蛋白

圖6 WB驗證lac-c-His6蛋白（用His的抗體）

決定生物學功能的潛在因素是基因的分子特征，本研究前期對黃孢原毛平革菌漆酶基因進行了載體的構建，成功克隆了黃孢原毛平革菌漆酶基因的cds區。序列分析表明，lac1680基因編碼的漆酶蛋白具有3個保守的結構域，通過與其它已報道的漆酶的保守結構相比較，經PCR擴增、SDS-PAGE及Western blotting雙重驗證，證實了我們所篩選得到的陽性轉化子表達的重組蛋白能夠被分泌，同時明確證實了基因lac1680能夠編碼分泌漆酶蛋白。

圖7 黃孢原毛平革菌（A）和工程菌（B）產漆酶能力折線圖

與目前國際上所采用的漆酶基因的克隆方法而言，傳統基因克隆一般采用探針雜交來獲得其全長的cDNA序列，也有運用RACE技術進行克隆基因的例子，但其最終目的都是為了提高漆酶基因的表達量，或者是提高漆酶活性。近年來對菌株產酶條件、降解條件的優化、漆酶載體的研究仍是研究熱點，例如鄧寒梅等［23］通過對固定化漆酶載體的研究來提高酶活性，張雪玲等［24］對漆酶Lac1338的酶學特性測定分析酶解染料影響。大腸桿菌重組菌具有生長快速、分泌能力強、易工業化生產等優點，雖然也有構建失敗的事例［25］，但迄今為止還是被人們認為是最具市場前景的前沿技術［26-27］。如楊建強等將野生革耳來源的漆酶基因在大腸桿菌中表達，得到可溶性漆酶蛋白，在可溶性漆酶蛋白中添加CuSO4并在室溫下孵育復性，獲得有活性的漆酶。

通過對比工程菌與野生型菌株所產生的粗酶液，酶的比活力相差不大，只是酶活力有所提高，這可能與該漆酶基因來自與同一物種有關，同時檢測重組蛋白所處的環境對酶活性也有一定的影響，后續將對構建好的工程菌酶學性質進行研究。未來在加強分子生物學和基因工程方面的研究，實現高效的異源表達，更加詳細的了解其功能，將其應用于實踐生產［28］。

4 結論

本研究以先前篩選到的高產漆酶的黃孢原毛平革菌為模板，利用同源克隆技術合成一個全長為1 680 bp的漆酶基因，將該基因連接到構建好的pET-24a載體上，并轉入大腸桿菌中，通過誘導表達，獲得漆酶蛋白。經過SDS-PAGE及Western Blotting雙重驗證，充分證明了我們得到的就是誘導純化后的漆酶，初步建立起漆酶基因的異源表達及重組蛋白純化體系。通過對比基因工程菌和野生型菌株在不同培養時間段內的酶活力，結果表明，構建好的工程菌活力比原菌酶活力提高了39%。

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