氧化脅迫對粉紅螺旋聚孢霉生長和產厚垣孢子的影響

王琦 馮靜紅 孫占斌 姜維治 李世東 孫漫紅 馬桂珍

（1. 淮海工學院，連云港 222005；2. 中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193）

在某些特定條件下，一些真菌的原生質體濃縮、細胞壁加厚，形成一種特殊的抗性結構——厚垣孢子。目前，有關厚垣孢子的形成機制尚不明確。有研究證明，通過改變環境條件，如溫度和通氣量等，能夠誘導真菌厚垣孢子的產生［1-2］。當環境不利于真菌生長時，營養菌絲轉化成厚垣孢子使菌體存活，待條件適宜時，厚垣孢子萌發，真菌繼續生長。因此，這種結構能抵御外界不良環境，對真菌的生長和存活具有十分重要的意義［3-4］。

環境中氧氣水平改變時會引起細胞內活性氧（Reactive oxygen，ROS）的變化。活性氧是生物體內一類具有強氧化、還原能力的氧自由基和含氧衍生物，主要包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（OH·）。低濃度下，活性氧作為信號分子在促進真核細胞生長、誘導細胞凋亡以及細胞抗氧化脅迫中發揮著積極作用［5-6］。但是當活性氧濃度超出機體抗氧化防御能力時，就會產生氧化脅迫（oxidative stress），損傷細胞活性，破壞細胞的生長與代謝［7-8］。氧化脅迫的大小與活性氧類型密切相關，Watts等［9］發現H2O2對E. coli細胞毒性最強，OH· 毒性最弱。不同作用時間作用效果也不相同，燕國梁等［10］發現接種前添加H2O2能刺激芽孢桿菌生長，而對數期添加則抑制細菌生長。微生物在適應氧化脅迫的過程中，會表現出不同的生理應答反應，如促使細胞分化、合成抗氧化物酶等［11-13］。Alonso-Monge等［14］發現，嚴重缺氧條件下白色念珠菌（Candida albicans）可以產生厚垣孢子。但迄今，有關氧化脅迫對絲狀真菌厚垣孢子形成的影響還未見報道。

粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea，異名：粉紅黏帚霉，Gliocladium roseum）是一類重要的生防真菌，可以防治多種植物真菌病害［15-17］。前期研究發現，一定條件下粉紅螺旋聚孢霉可以產生厚垣孢子。與分生孢子相比，厚垣孢子抗逆性增強，并且在土壤中萌發率顯著提高［18］，對提高粉紅螺旋聚孢霉生防制劑貨架期和防效穩定性具有重要意義。本實驗以粉紅螺旋聚孢霉高效菌株67-1為材料，通過改變液體培養通氣條件以及添加不同種類的活性氧，研究氧化脅迫對67-1菌絲生長和產厚垣孢子的影響，旨在探討活性氧水平與厚垣孢子形成之間的關系，為生防真菌厚垣孢子制劑研發和今后厚垣孢子形成機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 粉紅螺旋聚孢霉67-1，中國農業科學院植物保護研究所土傳病害生防實驗室保存。

1.1.2 液體培養基 葡萄糖25 g，酵母粉7.2 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，FeSO40.05 g，ZnSO4·7 H2O 0.05 g，蒸餾水1 L。裝液量為100/500 mL。

1.2 方法

1.2.1 液體培養 將67-1菌株在PDA 平板上28℃培養7 d，加入5 mL 無菌水，洗脫孢子，制備濃度為107/mL 的孢子懸液。吸取2 mL 孢子懸液接種于種子培養基中，28℃、180 r/min 振蕩培養48 h，按2%接種量接種進行擴大培養。28℃、180 r/min 恒溫振蕩培養72 h。

1.2.2 裝液量對67-1 菌絲生長及產厚垣孢子的影響 三角瓶中液體培養基裝量分別設定為20%、70%、80%、90%和100%，28℃、180 r/min 培養。48 h 觀察不同裝液量中67-1菌絲生長狀態，72 h血球計數板測定厚垣孢子和分生孢子的數量。每個裝液量3個重復。

1.2.3 H2O2對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響 分別在菌株接種前和培養16 h后向液體培養基中添加H2O2，接種前添加濃度分別為5、6、7、8和9 mmol/L，培養16 h 添加濃度分別為62、64、66和68 mmol/L，28℃下180 r/min 培養，觀察菌絲生長狀況，測定產孢數量。每個處理3個重復。

1.2.4 甲萘醌對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響 稱取一定量的甲萘醌溶于1 mL 丙酮溶液，然后加到100 mL 的液體培養基中。分別在接種前和培養16 h 后添加甲萘醌，接種前添加濃度分別為210、220、230、240和250 μmol/L，培養過程中添加濃度分別為 200、350 和 500 μmol/L。28℃、180 r/min 培養，測定67-1生長和產孢情況。培養基中添加1 mL丙酮溶液作為對照，每個處理3個重復。

1.2.5 OH· 對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響 液體培養基中加入0.278 g/L FeSO4· 7 H2O，以及不同濃度的H2O2，建立Fe2+-H2O2體系，通過Fenton 和Harber-weiss 反應生成羥基自由基。H2O2添加時間和添加量分別選取接種前5個濃度，1、2、3、4和5 mmol/L，培養16 h 后添加濃度為43、49、55和58 mmol/L。以只添加FeSO4· 7 H2O為對照，28℃、180 r/min 培養72 h。每個處理3個重復。

1.2.6 統計分析 利用SPSS 13.0 統計軟件對實驗數據進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 通氣量對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響

減少通氣量能夠抑制67-1菌絲生長和厚垣孢子形成。當搖瓶中發酵液裝量≤80% 時，菌絲生長正常。當裝液量達到90% 時，菌絲成束，極少產生分枝，厚垣孢子數量顯著降低，但占總孢子數的比例提高。當瓶中沒有多余空間時，菌絲生長受到嚴重抑制，僅形成極短的菌絲段，無孢子產生（圖1，表 1，圖 2）。

圖1 不同裝液量對67-1菌絲生長的影響

表1 不同裝液量對67-1生長的影響

圖2 不同裝液量對67-1產厚垣孢子的影響

2.2 H2O2對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響

培養過程中添加H2O2對67-1生長和產孢均有顯著影響。隨著添加濃度的增加，67-1生物量迅速下降。接種前添加5-6 mmol/L H2O2，其厚垣孢子數量較對照（3 × 106/mL）顯著增加（P＜ 0.05）。當濃度達到7 mmol/L 時，厚垣孢子數量顯著下降，但其比例增加（P＜ 0.05）。濃度達到 9 mmol/L 時，67-1生長和產孢完全受到抑制。真菌孢子萌發后（16 h）對H2O2的耐受力增強，濃度超過60 mmol/L 時，開始出現明顯的抑制，但在60-64 mmol/L 范圍內厚垣孢子比例顯著上升（P＜ 0.05，表2，圖3，圖6）。

表2 不同濃度H2O2 對67-1生長的影響

2.3 甲萘醌對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響

當甲萘醌濃度大于210 μmol/L 時，67-1菌絲生長和產孢受到明顯抑制，但在一定范圍內厚垣孢子的比例隨甲萘醌濃度的增加而增大。67-1培養過程中（16 h）菌絲對超氧陰離子自由基的耐受濃度較接種體（孢子）增加1倍，此時加入350 μmol/L 的甲萘醌，對厚垣孢子生成表現出明顯的促進作用，并且厚垣孢子比例最高（P＜ 0.05，表3，圖4，圖6）。

圖3 發酵液中添加H2O2對67-1產厚垣孢子的影響

表3 不同濃度甲萘醌對67-1生長的影響

2.4 羥基自由基對67-1菌絲生長及產厚垣孢子的影響

一定濃度的OH·能顯著提高67-1產厚垣孢子能力。在Fe2+-H2O2體系中，接種前添加1-5 mmol/L H2O2，67-1菌絲生長旺盛，厚垣孢子顯著增加，濃度為3 mmol/L 時產孢水平提高6倍以上。培養16 h后添加43-55 mmol/L H2O2厚垣孢子產量和比例顯著提高（P＜ 0.05，表 4，圖 5，圖 6）。

圖4 不同時期添加不同濃度甲萘醌對67-1產厚垣孢子的影響

表4 Fe2+-H2O2體系中添加不同濃度的H2O2對67-1生長的影響

3 討論

圖5 不同時期添加不同濃度羥基自由基對67-1產厚垣孢子的影響

圖6 不同種類活性氧對67-1厚垣孢子形成與形態的影響

通過改變裝液量調節液體培養基中氧氣含量，研究低氧脅迫下粉紅螺旋聚孢霉67-1生長和產厚垣孢子的變化。裝液量越大，氧含量越低，低氧脅迫越高。結果表明，菌絲和孢子都可以耐受一定程度的低氧脅迫，菌絲生長和產孢能力變化不大，但是當低氧脅迫超過某一閾值時，菌絲生長狀態改變，厚垣孢子產量顯著降低。趙文婧［19］研究發現，處于低氧脅迫環境下湯姆青霉（Penicillium thomii）菌絲分化形成大量的菌核，在67-1培養過程中發現，氧氣缺乏會造成菌絲分枝明顯減少，形成大量的菌絲束。這可能是由于不同微生物應對低氧脅迫表現的生理性應答不同。在低氧狀態下，菌體細胞代謝途徑可能發生改變，能量供應不足，有毒物質大量積累［20］，使菌株正常生長發育受到干擾。

添加一定濃度的H2O2、甲萘醌和羥基自由基，可以促進粉紅螺旋聚孢霉厚垣孢子的形成，但是會一定程度抑制菌絲的生長，推測在不同類型活性氧的刺激下真菌菌絲大量轉化成厚垣孢子來度過不良環境。厚垣孢子是真菌的一種休眠體結構，通常在逆境條件下產生，具有較強的適應和抗逆能力。粉紅螺旋聚孢霉受到氧化脅迫刺激后，通過產生厚垣孢子，維持自身的存活。

厚垣孢子的抗逆性可能與其細胞壁結構密切有關。厚垣孢子細胞壁由內外兩層壁組成，燕瑋婷［21］認為，水稻稻曲病菌的休眠特性與細胞壁中多糖含量較高有關。閆越［22］發現，隨著培養時間的延長黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）厚垣孢子的內層細胞壁不斷增厚，其中含有較高濃度的多糖和蛋白，因而具有較強的抗壓能力。我們推測67-1厚垣孢子的抗逆性也與其細胞壁結構相關，但尚需進一步證明。目前，關于粉紅螺旋聚孢霉厚垣孢子形成機制還不明確，利用優化的條件為下一步深入研究厚垣孢子形成機制奠定了基礎。

4 結論

氧化脅迫能夠影響粉紅螺旋聚孢霉菌絲生長狀態和產厚垣孢子能力。氧環境下，菌絲分枝減少，厚垣孢子數量降低。發酵過程中添加一定濃度的活性氧可以促進粉紅螺旋聚孢霉厚垣孢子的形成。

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