榆黃菇遺傳多樣性的ISSR和SRAP綜合分析

武海月 趙爽 劉宇 李華敏 宋爽 牛玉蓉 榮成博

（1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所 北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京 100097；2. 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3. 北京農(nóng)學(xué)院資源與環(huán)境系，北京 102206；4. 魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，煙臺(tái) 264025）

榆黃菇（Pleurotus citrinopileatus）又名金頂側(cè)耳、金頂蘑，屬擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae）， 側(cè) 耳 屬（Pleurotus（Fr.）Quel.）［1］。其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中氨基酸含量尤為豐富，且必需氨基酸含量高［2］。榆黃菇屬高營(yíng)養(yǎng)、低熱量食品，長(zhǎng)期食用，有降低血壓、降低膽固醇含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖癥患者的理想保健食品［3］。

榆黃菇的人工栽培開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)在已經(jīng)能夠進(jìn)行周年栽培。但是到目前為止，在栽培上大都將采集的野生菌株直接用于生產(chǎn)，或者經(jīng)過(guò)篩選馴化后作生產(chǎn)用菌種，新品種選育的報(bào)道較為少見(jiàn)［4］。食用菌種質(zhì)資源是優(yōu)良品種育種的基礎(chǔ)材料，育種成效除了取決于掌握種質(zhì)資源的數(shù)量，還很大程度取決于對(duì)這些種質(zhì)資源多樣性的遺傳特性掌握。分子標(biāo)記作為食用菌遺傳多樣性研究中的一個(gè)重要手段，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛［5］。

ISSR 是由 Zietkeiwitcz等［6］1994年創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，結(jié)合了RAPD和SSR方法的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有穩(wěn)定性和高重復(fù)性的分子標(biāo)記方法，被廣泛應(yīng)用于食用菌方向［7-8］。SRAP是一種由美國(guó)加州大學(xué)Li等［9］開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)，利用上游引物針對(duì)外顯子區(qū)域，下游引物對(duì)內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，上游引物和下游引物自由結(jié)合，配對(duì)出不同組合進(jìn)行反應(yīng)。由于物種及個(gè)體間的差異導(dǎo)致內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列不同進(jìn)而產(chǎn)生多態(tài)性。

由于每一個(gè)方法的開(kāi)發(fā)原理不同，聚類分析結(jié)果通常會(huì)存在較大的差異，將多個(gè)分子標(biāo)記綜合運(yùn)用能最大優(yōu)化聚類分析結(jié)果。目前，榆黃菇還沒(méi)有系統(tǒng)的遺傳多樣性分析，鑒于此，本研究采用ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記的方法，對(duì)收集自全國(guó)19個(gè)榆黃菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性研究，旨為榆黃菇的分類鑒定、遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所用菌株的名稱及來(lái)源參見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（BD Difco），蛋白胨（OXIOD），分析純磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學(xué)試劑，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；2×TaqPCR MasterMix購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉40 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、VB110 mg、水1 000 mL。

表1 供試菌株及其來(lái)源

1.1.3 儀器 PCR儀（Eppendorf Mastercycler Gradient）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Labtech UV9100）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、電子分析天平（奧豪斯）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 取在PDA平板上活化7-10 d的榆黃菇菌種，刮取少量菌絲作為實(shí)驗(yàn)材料，DNA的提取參照許峰等［10］方法。ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照馮偉林等［11］方法，ISSR-PCR反應(yīng)的總體積為 25 μL，體系為 ：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L 引 物（1 μL），20-50 ng DNA（1 μL），加滅菌雙蒸水（10.5 μL）至 25 μL。將反應(yīng)液按上述體積加入0.2 mL 離心管中，混勻，放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

ISSR-PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性4 min，然后94℃變性30 s，以低于引物Tm值溫度5℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照邊銀丙等的方法［12］，SRAP-PCR 反應(yīng)的總體積為 25 μL，體系 為 ：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L引物 R（1 μL）、引物 F（1 μL），20-50 ng DNA（1 μL），加滅菌雙蒸水（9.5 μL）至 25 μL。將反應(yīng)液按上述體積加入0.2 mL 離心管中，混勻，放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

SRAP-PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性7 min，94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，共38個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

取8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（2%），置于紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄。（所用引物參見(jiàn)表2-3）

表2 ISSR分析用引物

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析 上述電泳圖譜中同一水平上將擴(kuò)增出的強(qiáng)帶或分辨性好的弱帶，均視為擴(kuò)增陽(yáng)性，并賦值“1”，未擴(kuò)增出條帶視為擴(kuò)增陰性，賦值“0”，用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 供試菌株ISSR分析結(jié)果

以提取的19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板，通過(guò)對(duì)不同引物的PCR擴(kuò)增篩選，選出10條引物（表2）在供試菌株上擴(kuò)增效果良好，每個(gè)菌株都可以通過(guò)PCR擴(kuò)增出DNA條帶，且條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好、分布合理。10條引物共擴(kuò)增出102條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為80個(gè)，多態(tài)性為78.4%（表4）。

表3 SRAP分析用引物

不同引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)不等，其序列長(zhǎng)度大多為200-2 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息（圖1-圖2）。

2.2 供試菌株SRAP分析結(jié)果

以提取的19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板，通過(guò)對(duì)不同引物的PCR擴(kuò)增篩選，獲得的10對(duì)引物（表3）在供試菌株上擴(kuò)增效果良好，每個(gè)菌株都可以通過(guò)PCR擴(kuò)增出DNA條帶，且條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好、分布合理。10對(duì)引物共擴(kuò)增出92條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為70條，多態(tài)性為76.1%（表5）。

不同引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)不等，其序列長(zhǎng)度大多為200-2 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息（圖3-圖4）。

2.3 供試菌株聚類分析結(jié)果

綜合20條引物擴(kuò)增出的194條DNA片段，其中多態(tài)性條帶150條，多態(tài)性達(dá)77.3%。用NTSYSpc 2.10軟件對(duì)19個(gè)榆黃菇供試菌株進(jìn)行聚類分析，獲得各菌株間的聚類圖（圖5）。

根據(jù)聚類分析結(jié)果可知，在相似系數(shù)為0.70水平上，可將19個(gè)供試榆黃菇菌株分為4大類，表明19個(gè)供試榆黃菇菌株間具有較大的遺傳差異，第一類包括01號(hào)、03號(hào)、04號(hào)、06號(hào)，第二類包括02號(hào)、05號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、17號(hào)，第三類為13號(hào)，第四類包括07號(hào)、08號(hào)、09號(hào)、10號(hào)、14號(hào)、18號(hào)、19號(hào)；而在 0.96的相似值水平上，除09號(hào)和10號(hào)兩個(gè)菌株未區(qū)分開(kāi)外，其余17個(gè)菌株均可單獨(dú)分開(kāi)。

表4 ISSR多態(tài)性

圖1 引物P4對(duì)19株榆黃菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

食用菌菌種的鑒定和保護(hù)是食用菌產(chǎn)業(yè)的重要問(wèn)題，市場(chǎng)上常出現(xiàn)“同名異物“或”同物異名”的現(xiàn)象，不僅不利于育種者的積極性也給生產(chǎn)者帶了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。傳統(tǒng)的菌種鑒別是在子實(shí)體層次對(duì)子實(shí)體的顏色、大小、朵型等形態(tài)特征及其生理生化反應(yīng)特征、栽培特性等為依據(jù)，易受生長(zhǎng)環(huán)境的影響，一般只能鑒定到屬內(nèi)種間這一水平，而對(duì)于種內(nèi)菌株卻難以鑒別，且整個(gè)鑒定流程時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確率低［3］。

表5 SRAP多態(tài)性

圖2 引物826對(duì)19株榆黃菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 引物me2/em2 對(duì)19株榆黃菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果

圖5 19個(gè)榆黃菇菌株的聚類分析圖

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)（RAPD，ISSR 和 SRAP）應(yīng)用于食用菌的分類鑒定［13］。周潔等［8］利用11個(gè)ISSR引物對(duì)40個(gè)姬菇雜交菌株及2個(gè)親本菌株進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，42個(gè)供試菌株遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.428 6-0.853 7，在相似系數(shù)0.668 0時(shí)，42個(gè)菌株聚為7類，兩親本各具一類，雜交菌株與親本菌株遺傳差異較大。許峰等［10］利用9對(duì)SRAP引物對(duì)22個(gè)白色金針菇進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)0.820水平時(shí)，將供試菌株分為5大類，技術(shù)揭示了北京地區(qū)金針菇菌株的遺傳多樣性。張靜等［14］運(yùn)用SRAP，ISSR和RAPD技術(shù)對(duì)40個(gè)雙胞蘑菇進(jìn)行分析，其中SRAP平均多態(tài)率為70.21%；ISSR平均多態(tài)率為78.33%；RAPD平均多態(tài)率為61.94%，根據(jù)距離值不同，將40個(gè)雙孢蘑菇分為6個(gè)或9個(gè)類群，更好的解釋供試菌株間的親緣關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)的分子標(biāo)記技術(shù)在香菇［15］、木耳［16］等食用菌方面應(yīng)用較廣泛，但榆黃菇的報(bào)道較少，張秋勝等［17］和崔丹等［18］僅運(yùn)用ISSR技術(shù)分析榆黃菇的遺傳多樣性。由于每一個(gè)方法的開(kāi)發(fā)原理不同，聚類分析結(jié)果通常會(huì)存在比較大的差異，將多個(gè)分子標(biāo)記綜合運(yùn)用能最大優(yōu)化聚類分析結(jié)果［19］。

本實(shí)驗(yàn)共收集了不同地區(qū)的19個(gè)榆黃菇品種，通過(guò)ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)，利用篩選的引物以19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一共擴(kuò)增出194條DNA片段，其中，多態(tài)性條帶有150個(gè)，多態(tài)性比例為50%-100%不等，平均為77.3%，說(shuō)明19種榆黃菇遺傳多樣性比較豐富，可以利用和開(kāi)發(fā)的菌種資源較多；不同引物擴(kuò)增出每種DNA的條帶數(shù)量不等，為3-13條，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200-2 000 bp，包含了豐富的多態(tài)性。聚類分析結(jié)果表明：19株榆黃菇菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.67-0.95，在相似系數(shù)為0.70水平上，可將19個(gè)供試榆黃菇菌株分為4大類。7號(hào)和8號(hào)菌株同是引自山東莒縣的菌株，聚類分析結(jié)果中聚為一簇，說(shuō)明榆黃菇品種存在一定的地域性；11號(hào)和16號(hào)是來(lái)自不同地區(qū)的品種，親緣關(guān)系雖然較近，但是仍然存在一定的差異，說(shuō)明不是一個(gè)品種或同一品種通過(guò)不斷的傳代已經(jīng)發(fā)生遺傳變異；通過(guò)目前的手段沒(méi)有能夠區(qū)分9號(hào)和10號(hào)菌株，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系很近，且兩種菌株都是來(lái)自于江蘇高郵，可能是同物異名。

本研究應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平上系統(tǒng)分析評(píng)估榆黃菇種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為榆黃菇種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)和育種提供了理論支持。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選出適合供試榆黃菇菌株的10條ISSR引物和10對(duì)SRAP引物，利用篩選的引物以19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一共擴(kuò)增出194條DNA片段，其中，多態(tài)性條帶有150個(gè)，多態(tài)性比例為50%-100%不等，平均為77.3%，說(shuō)明19個(gè)榆黃菇遺傳多樣性比較豐富；不同引物擴(kuò)增出每種DNA的條帶數(shù)量不等，為3-13條，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200-2 000 bp，包含了豐富的多態(tài)性。聚類分析結(jié)果表明：在相似系數(shù)為0.70水平上，可將19個(gè)供試榆黃菇菌株分為4大類，表明19個(gè)供試榆黃菇菌株間具有較大的遺傳差異。

［1］ 熊芳, 鄭閩江, 劉新銳, 等. SCAR標(biāo)記技術(shù)鑒別榆黃蘑品種［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2010（3）：593-597.

［2］ 王玥瑋, 王麒琳, 張立娟. 榆黃蘑營(yíng)養(yǎng)成分及其生物活性的研究進(jìn)展［J］. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2017, 38（4）：201-203.

［3］ 潘春磊, 王延鋒, 黃文, 等. 榆黃蘑10個(gè)菌株的農(nóng)藝性狀篩選及評(píng)價(jià)［J］. 中國(guó)食用菌, 2015（6）：13-16.

［4］ 張玉鐸. 榆黃蘑單孢雜交及后代篩選［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

［5］ 吳學(xué)謙, 李海波, 魏海龍, 等. SCAR分子標(biāo)記技術(shù)在香菇菌株鑒定上的應(yīng)用研究［J］. 菌物學(xué)報(bào), 2005, 24（2）：259-266.

［6］ Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］. Genomics, 1994, 20（2）：176-183.

［7］ Liu J, Wang ZR, Li C, Bian YB, Xiao Y. Evaluating genetic diversity and constructing core collections of ChineseLentinula edodescultivars using ISSR and SRAP markers［J］. Journal of Basic Microbiology, 2015, 55（6）：749-760.

［8］ 周潔. ISSR分子標(biāo)記在姬菇雜交菌株鑒定中的應(yīng)用［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

［9］ Li G, Quiros CF. Sequence -related amplified polymorphism（SRAP）, a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging inBrassica［J］.Theoretical and Applied Genetics, 2001, 103：455-461.

［10］ 許峰, 劉宇, 王守現(xiàn), 等. 北京地區(qū)白色金針菇菌株的SRAP分析［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26（10）：55-59.

［11］ 馮偉林, 蔡為明, 金群力, 等. ISSR分子標(biāo)記分析杏鮑菇菌株遺傳差異研究［J］. 中國(guó)食用菌, 2009, 28（1）：47-49.

［12］ 邊銀丙, 宋小亞. 幾種新型DNA分子標(biāo)記及其在食用菌研究中的應(yīng)用［J］. 食用菌學(xué)報(bào), 2006, 13（1）：78-81.

［13］ 張瑞穎, 胡丹丹, 左雪梅, 等. 分子標(biāo)記技術(shù)在食用菌遺傳育種中的應(yīng)用［J］. 中國(guó)食用菌, 2011（1）：3-7.

［14］ 張靜, 陳文炳, 邵碧英, 等. 雙孢蘑菇SRAP、ISSR、RAPD標(biāo)記遺傳多樣性和菌群分類研究［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2010, 10（6）：7-13.

［15］ 賈定洪, 王波, 鄭林用, 等. 應(yīng)用拮抗及ISSR方法鑒定袋料香菇菌株［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 26（2）：832-834.

［16］ 劉華晶. 基于不同分子標(biāo)記的黑龍江省野生黑木耳遺傳多樣性分析［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué), 2011.

［17］ 張秋勝, 徐丙蓮, 劉林德, 等. 中國(guó)金頂側(cè)耳菌株遺傳多態(tài)性的ISSR分析［J］. 食品科學(xué), 2011, 32（05）：172-175.

［18］ 崔丹. 金頂側(cè)耳種質(zhì)資源多樣性的研究［D］. 吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

［19］ 曲紹軒, 高山, 黃晨陽(yáng). SRAP、ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在銀耳菌株鑒別上的應(yīng)用［J］. 食用菌學(xué)報(bào), 2007, 14（3）：1-5.