釀酒酵母PMT1與PMT3雙基因缺失對(duì)細(xì)胞壽命的影響

崔紅晶 周濤 邱堃佩 宋浩昌 劉新光

（廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東莞市衰老與抗衰老重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為研究衰老機(jī)制的經(jīng)典模式生物，既具有原核生物生長(zhǎng)快、基因操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，又具有真核生物翻譯后加工修飾的功能特點(diǎn)［1］。研究酵母發(fā)現(xiàn)其具有多條比較保守的參與壽命調(diào)控的通路（如Sch9p、Tor1p 和Ras/PKA），且這些通路與哺乳動(dòng)物的信號(hào)通路都很相似。因此，通過研究酵母中人類的同源基因，可以獲得功能未知人類新基因的相關(guān)信息，為進(jìn)一步研究高等生物細(xì)胞壽命的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。

釀酒酵母蛋白質(zhì)O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（ProteinO-mannosyltransferase，PMT）家族是一類進(jìn)化上保守的酶類，共有7個(gè)成員（Pmt1-7p），分為PMT1、PMT2和PMT4三個(gè)亞家族，具有50%-80%同源性，彼此之間有信息互補(bǔ)的特點(diǎn)。酵母PMT家族甘露糖基化修飾未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)翻譯后的加工成熟，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡［2-4］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示酵母PMT家族中PMT1基因缺失延長(zhǎng)細(xì)胞的復(fù)制性壽命，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路的活性密切相關(guān)［5］。本文主要研究PMT3單基因缺失，以及PMT1與PMT3雙基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞壽命的影響，旨為進(jìn)一步探討PMT家族其它成員在酵母壽命調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用，以及為甘露糖基化修飾反應(yīng)與人類相關(guān)疾病的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Easy Taq DNA聚合酶（貨號(hào)：AP111）、HiFi DNA聚合酶（貨號(hào)：AP131）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的限制性內(nèi)切酶MluⅠ購(gòu)自TaKaRa公司；酵母提取物（貨號(hào)：LP0021）和胰蛋白胨（貨號(hào)：LP0042）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；SD培養(yǎng)基（貨號(hào)：630411和630412）和限制性氨基酸（貨號(hào)：630414）購(gòu)自Clontech公司。

1.1.2材 料釀 酒 酵 母 BY4742（MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）、PMT1基因缺失菌株（pmt1Δ）、感受態(tài)大腸桿菌（DH5α）、載體pRS306和重組載體pRS305-pmt3-ko為實(shí)驗(yàn)室保存。載體為低拷貝穿梭載體，在大腸桿菌中具有氨芐青霉素抗性，分別帶有Ura和Leu營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)簽。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，如表1。

1.2 方法

1.2.1PMT3基因缺失菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［6-7］。以載體pRS306為模板，PMT3-F和PMT3-R為引物，PCR擴(kuò)增PMT3基因破壞元件。采用醋酸鋰方法將破壞元件轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型酵母細(xì)胞（BY4742），經(jīng)Ura營(yíng)養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基篩選。PCR鑒定陽性克隆基因組DNA，鑒定引物分別為PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物（V-Pmt3-F/V-Pmt3-R），營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)簽URA3基因內(nèi)部引物和PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物（URA-int-F/V-Pmt3-R），采用Easy Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書進(jìn)行。

表 1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.2PMT1與PMT3雙基因缺失菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［5，8-9］。限制性內(nèi)切酶MluⅠ酶切重組載體pRS305-pmt3-ko，采用醋酸鋰方法將線性化重組載體轉(zhuǎn)化pmt1Δ酵母細(xì)胞。經(jīng)過Leu和Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選，PCR鑒定陽性克隆基因組DNA，鑒定引物分別為營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)簽LEU2基因內(nèi)部引物（Leu-int-F/Leu-int-R），PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物（Pmt3-N-F/Pmt3- C-R），PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物與營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)簽LEU2基因內(nèi)部引物（V-Pmt3-F/Leu-int-R），PMT3基因開放閱讀框內(nèi)部引物（Pmt3-int-F/Pmt3-int-R），及鑒定pmt1Δ菌株所需的引物（V-Pmt1-F/V-Pmt1-R；URA-int-F/ V-Pmt1-R）。采用TransTaqHiFi DNA 聚合酶，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書進(jìn)行。

1.2.3復(fù)制性壽命檢測(cè)釀酒酵母復(fù)制性壽命的檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［10-11］。在光學(xué)顯微鏡下利用纖維操作系統(tǒng)分離、統(tǒng)計(jì)酵母母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞的數(shù)目。采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。壽命兩組間的分析采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，復(fù)制性壽命用平均數(shù)表示。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMT3基因破壞元件擴(kuò)增結(jié)果

PMT3基因破壞元件（含URA3基因編碼序列）全長(zhǎng)1 232 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)正確（圖1）。

圖1 PMT3基因破壞元件擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PMT3基因缺失菌株的鑒定

破壞元件轉(zhuǎn)化野生型酵母細(xì)胞（BY4742），PCR驗(yàn)證陽性克隆和野生型酵母細(xì)胞基因組DNA，結(jié)果（圖2）顯示，引物V-Pmt3-F和V-Pmt3-R所擴(kuò)增片段大小分別為1 619 bp和2 734 bp；引物URA-int-F和V-Pmt3-R所擴(kuò)增片段分別為710 bp和0 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMT3基因缺失菌株（pmt3Δ）構(gòu)建成功。

圖 2 PMT3基因缺失酵母菌株的驗(yàn)證圖

2.3 PMT1與PMT3雙基因缺失菌株的鑒定

基于基因同源重組的原理，構(gòu)建PMT1與PMT3雙基因缺失菌株。PCR方法驗(yàn)證陽性克隆和野生型酵母細(xì)胞基因組DNA，結(jié)果（圖3）顯示，引物L(fēng)eu-int-F和Leu-int-R所擴(kuò)增片段大小分別為1 097 bp和0 bp；引物Pmt3-N -F和Pmt3-C-R所擴(kuò)增片段大小分別為6 502 bp和3 262 bp；引物V-Pmt3-F和Leu-int-R所擴(kuò)增片段大小分別為3 740 bp和0 bp；引物Pmt3-int-F和Pmt3-int-R所擴(kuò)增片段大小分別為0 bp和358 bp；引物V-Pmt1-F和V-Pmt1-R所擴(kuò)增片段大小分別為1 710 bp和2 932 bp；引物URA-int-F和V-Pmt1-R所擴(kuò)增片段大小分別為771 bp和0 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMT1與PMT3雙基因缺失菌株（pmt1Δpmt3Δ）構(gòu)建成功。

圖 3 PMT1與PMT3雙基因缺失酵母菌株的驗(yàn)證圖

2.4 酵母菌株的復(fù)制性壽命

選取BY4742、PMT3基因缺失菌株（pmt3Δ）和雙基因缺失菌株（pmt1Δpmt3Δ），檢測(cè)酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。結(jié)果（圖4）顯示，與BY4742酵母細(xì)胞的壽命（平均26代）比較，pmt3Δ菌株的壽命無明顯變化，平均壽命為24代（P＞ 0.05），pmt1Δpmt3Δ菌株的壽命也無明顯變化，平均壽命為25代（P＞ 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMT3基因缺失不影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，PMT1和PMT3雙基因缺失也不影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。

3 討論

釀酒酵母PMT家族參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯后的糖基化修飾反應(yīng)，這一糖基化修飾反應(yīng)在多種細(xì)胞生物學(xué)功能中起著非常重要作用［12-15］。酵母PMT家族成員之間易形成聚合體，且主要以Pmt1p-Pmt2p、Pmt3p-Pmt5p和Pmt4p-Pmt4p幾種聚合體形式存在，并最大發(fā)揮其生物學(xué)功能。在敲除一個(gè)基因的前提下，Pmt1p-Pmt3p或Pmt2p-Pmt5p也可形成聚合體，這種協(xié)同補(bǔ)償作用能維持酵母細(xì)胞內(nèi)甘露糖轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖［16］。

圖4 BY4742、pmt3Δ菌株和 pmt1Δpmt3Δ菌株復(fù)制性壽命曲線圖

釀酒酵母是以非對(duì)稱性分裂的方式出芽，每次都能分裂出一個(gè)比自己小的子細(xì)胞，通過研究酵母母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞的數(shù)量，反應(yīng)酵母細(xì)胞的分裂增殖能力［17］。本課題組前期研究結(jié)果提示PMT家族中PMT1基因缺失延長(zhǎng)酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，PMT2基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞的壽命無明顯影響［5，18］。為探討PMT家族其它成員基因缺失與細(xì)胞分裂增殖之間的關(guān)系，本文研究PMT3基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞復(fù)制性壽命的影響，基于基因同源重組的原理［5，9］，構(gòu)建了PMT3單基因缺失酵母菌株，重組發(fā)生在染色體水平上，表型穩(wěn)定遺傳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失PMT3基因沒有影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，提示酵母PMT家族單基因?qū)?xì)胞的正常分裂增殖來說是非必需的。

研究已報(bào)道PMT家族中雙基因缺失的酵母細(xì)胞表現(xiàn)為甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性降低，細(xì)胞形態(tài)變化，生長(zhǎng)缺陷等特征。三基因缺失的酵母細(xì)胞僅在滲透壓穩(wěn)定環(huán)境中存活［19］。如PMT1和PMT2雙基因缺失的酵母細(xì)胞甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性約為野生型酵母細(xì)胞的20%，雙基因或三基因缺失的酵母細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)核仁，細(xì)胞生長(zhǎng)較慢等表型特征，推測(cè)這可能與細(xì)胞內(nèi)甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性過低相關(guān)［20］。為進(jìn)一步探討雙基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞分裂增殖的影響，本文研究PMT1與PMT3雙基因缺失菌株的復(fù)制性壽命，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMT1與PMT3雙基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞的壽命無明顯影響。推測(cè)此雙基因缺失影響了Pmt1p-Pmt3p聚合體的形成，但并不影響Pmt2p-Pmt5p等其它聚合體的生物學(xué)功能，提示PMT家族其它成員可能補(bǔ)償了雙基因缺失在細(xì)胞內(nèi)的生理功能，但具體的機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

基于基因同源重組的原理，本文成功構(gòu)建釀酒酵母PMT3單基因缺失菌株和PMT1與PMT3雙基因缺失菌株。通過酵母光學(xué)顯微鏡檢測(cè)野生型酵母菌株和基因缺失酵母菌株的復(fù)制性壽命，結(jié)果顯示缺失PMT3基因不影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，且PMT1和PMT3 雙基因缺失菌株的壽命亦無明顯變化。

致謝：感謝美國(guó)華盛頓大學(xué)Matt Keaberlein教授和美國(guó)BUCK衰老研究所Brian K Kennedy博士贈(zèng)送的BY4742菌株和質(zhì)粒，以及在酵母實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予的精心指導(dǎo)。

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