深海真菌Dichotomomyces cejpii膠霉毒素生物合成基因啟動子的克隆和功能鑒定

黃自磊 章衛民 葉偉 李賽妮 李浩華 朱牧孜

（1. 中國科學院南海海洋研究所，廣州 510301；2. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070；3. 中國科學院大學，北京 100049）

膠霉毒素（Gliotoxin）主要是由煙曲霉（Aspergillus fumigatus）產生的一類含硫二酮哌嗪（ETPs）類化合物，能夠結合含硫蛋白，破壞細胞內的氧化還原反應平衡［1-3］。膠霉毒素具有廣譜抑菌、抑病毒、抗腫瘤和免疫調節活性，也可制備成殺菌劑和除草劑防治植物病害，有很好的應用前景［4］。據報道，GliG、GliI和GliO是煙曲霉膠霉毒素生物合成所必須的功能基因［5］。啟動子作為結構基因和功能基因轉錄調控的必要元件，能夠募集轉錄因子與RNA聚合酶精確的起始轉錄［6-7］。近年來，絲狀真菌在新型、高活性次級代謝產物的發掘以及活性酶的研究和開發方面發展迅速，且絲狀真菌中啟動子對其內源基因的轉錄活性較高，因此很多不同種屬絲狀真菌的啟動子被發掘出來，如木霉屬（Trichoderma）pki1啟動子，里氏木霉（T. reesei）的cbh1、tef1啟動子和gpdA啟動子，曲霉屬（Aspergillus）的glaA啟動子等［8-9］。本課題組前期從深海真菌Dichotomomyces cejpii中分離得到多個膠霉毒素，它們具有良好的生物活性［10］，進一步對該真菌進行了轉錄組測序，結果表明基因GliG、GliI和GliO分別編碼谷胱甘肽硫轉移酶、轉氨酶和醛還原酶。目前，關于深海真菌D. cejpii中膠霉毒素的生物合成基因及其啟動子的功能未見報道。本研究采用染色體步移技術對D. cejpii中膠霉毒素的生物合成關鍵基因GliG、GliI、GliO啟動子進行克隆，并采用熒光素酶報告基因載體和潮霉素抗性基因表達載體進行功能驗證，從而為后期通過轉錄調控和異源表達以獲得更多高活性的新型膠霉毒素奠定分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 DNA膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒（天根生化試劑公司，北京），HiPure Plant RNA Mini Kit（美基生物科技有限公司，廣州），Genome walking kit、PrimeSTAR MAX Premix（TaKaRa，大連），2x Taq master mix（Microanalysis生物科技公司，北京），DNA Marker 2k、trans 2k plus II、1k（全式金生物技術有限公司，北京），All-in-one RT Master Kit（Abm， 加 拿 大 ），TransStart Tip Green qPCR SuperMix（+Dye II）（全式金生物技術有限公司，北京），細胞超聲破碎儀（Sonics，美國），GloMax 20/20熒光光度計（Promega，美國），熒光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，上海）

1.1.2 菌株和載體 深海真菌Dichotomomyces cejpii分離自南海沉積物［11］，pGL3-Basic載體（淼靈生物科技有限公司，武漢），pAN7-1質粒（淼靈生物科技有限公司，武漢），Trans5α感受態細胞（全式金生物技術有限公司，北京），BL21（DE3）感受態細胞（全式金生物技術有限公司，北京），pEASY-T1 Cloning Kit（全式金生物技術有限公司，北京），釀酒酵母BY4742，保藏于廣東省微生物研究所。

1.2 方法

1.2.1D. cejpii轉錄組測序 將深海真菌D. cejpii接種于YPD培養基平板，37℃培養72 h，挑取新鮮的菌絲體，利用植物RNA提取試劑盒提取RNA，利用All-in-one RT Master Kit逆轉錄獲得cDNA，并采用Hiseq2000進行轉錄組測序，通過前期轉錄組測序得到的目的基因序列設計基因GliG、GliI、GliO引物，引物序列為：GliG（FP：5'-atgaccgaacgacc ttcttgatctcg-3'，RP ：5'-caatagtccatactccttctcgcc-3'），GliI（FP ：5'-atgcctcacgcagaaacactcccc-3'，RP ：5'-ccacctcttatccacccccaatg-3'），GliO（FP：5'-atggccaattctcgacccaacatcg-3'，RP：5'-gttgaagttatccaggattgcg-3'），以cDNA為模板進行熒光定量PCR，分析這3個基因的相對表達量，并通過瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證目的基因的表達水平。

1.2.2GliG、GliI、GliO啟動子的克隆和序列分析 根據前期轉錄組測序結果，利用Genome walking kit試劑盒，設計GliG、GliI、GliO序列中特異性反向引物（表1），并利用正向引物AP3進行巢式PCR擴增，并將最后一步的PCR片段利用pEASY-T1試劑盒進行TA克隆，轉化至trans5α感受態細胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選出陽性克隆，利用T7-F和T7-ter引物進行菌液PCR驗證陽性克隆并測序，獲得目的基因GliG、GliI、GliO上游啟動子序列，并利用啟動子預測軟件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）分析啟動子序列，獲得啟動子的核心區域。

1.2.3 啟動子-pGL3-Basic載體及啟動子-pAN7-1-2μ復制子載體構建 根據克隆得到的GliG上游核心啟動子片段以及pgpd啟動子，設計單一酶切位點的引物，pgpd啟動子上下游引物分別加酶切位點XhoI和Hind III，GliG核心啟動子上下游引物分別加酶切位點NheI和Hind III，與pGL3-Basic載體對應的酶切產物連接轉化構建載體。GliI/GliO核心啟動子通過環形聚合酶延伸克隆（Circular polymerase extension coloning，CPEC）技術設計同源臂引物，與線性載體進行重疊延伸PCR構建載體［12］：設計GliI/GliO啟動子核心區域引物以及pGL3-Basic載體引物，保證載體和片段有20 bp重疊區域，利用Max酶進行三步PCR反應，程序為：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min，克隆出目的片段和載體片段，膠回收試劑盒純化，并將克隆出的啟動子核心目的片段以及pGL3-Basic載體片段各1 μL（濃度為50 ng/μL以上）用于10 μL PCR體系中，不加引物，進行環化連接克隆，轉化trans5α，利用菌落PCR篩選陽性克隆并測序，驗證載體構建結果。GliG上游核心啟動子區域和2μ-pAN7-1載體的構建：先利用CPEC法將酵母2μ復制子插入到pAN7-1載體中，然后利用酶切連接的方法，對GliG核心啟動子設計BglII和PshA I酶切位點的上下游引物，PCR擴增并酶切，與酶切后的2μ-pAN7-1載體連接轉化，將目的基因GliG上游核心啟動子區域取代pgpdA啟動子，構建2μ-pAN7-1-GliG核心啟動子載體，并電轉入釀酒酵母細胞中，利用不同濃度（0、50、100、150、200 μg/mL）潮霉素抗性平板進行篩選和驗證。

表1 目的基因GliG、GliI、GliO特異性反向引物序列

1.2.4 啟動子熒光素酶活性檢測 將構建成功的含有目的基因啟動子的重組pGL3-Basic質粒載體，空載體pGL3-Basic（陰性對照）和pgpd-pGL3-basic載體（陽性對照，pgpd是真菌雙孢蘑菇中分離鑒定的啟動子［13］，能有效啟動目的基因的表達）分別轉化到trans5α感受態細胞，利用氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，并測序驗證。將陽性克隆擴大培養，利用質粒小量提取試劑盒提質粒，并轉化BL21（DE3）感受態細胞，挑取單菌落并保種。含有pGL3-basic-空載/GliG/GliI/GliO/pgpd質粒的trans5α以及BL21（DE3）感受態細胞分別于20 mL LB液體培養基中擴大培養，37℃、200 r/min搖床培養，當OD值為0.8-1.0，8 000 r/min離心5 min取沉淀，并用PBS緩沖液洗滌2-3次，最后用2 mL的PBS緩沖液溶解，并進行細胞超聲破碎（振幅 40%，工作5 s/停頓5 s）10 min，10 000 r/min離心取上清置于冰上。取上清100 μL和螢火蟲熒光素酶檢測試劑100 μL與1.5 mL EP管中混勻，用熒光光度計檢測不同重組菌上清的RU值，反應時間為5 s。

1.2.5 潮霉素抗性基因表達驗證 用不同濃度（0、50、100、150、200、250 μg/mL）的潮霉素抗性平板對釀酒酵母抗性進行篩選，30℃培養3 d，確定潮霉素對于釀酒酵母的最適篩選濃度。制備釀酒酵母感受態細胞［14］，將 2μ-pAN7-1 載體以及 2μ-pAN7-1-GliG載體分別電轉入釀酒酵母細胞中（1 500 V，5 ms），均勻涂布于潮霉素抗性平板中，并利用菌落PCR篩選陽性克隆，并進一步測序驗證。

2 結果

2.1 GliG、GliI、GliO的表達水平分析

以D. cejpii的cDNA為模板進行熒光定量PCR，結果表明，目的基因GliG的相對表達水平顯著高于GliI基因和GliO基因（P＜0.01）（圖1-A）。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，GliG對應條帶明顯亮于GliI、GliO對應條帶（圖1-B），說明GliG基因表達水平相對較高，在D. cejpii膠霉毒素生物合成過程中發揮重要作用。

2.2 GliG、GliI、GliO啟動子的克隆分析

通過3-4次巢式PCR反應對D. cejpii基因組擴增，得到對應目的片段，I4（GliI啟動子第4輪擴增）約2.5 kb，O4（GliO啟動子第4輪擴增）約為3.1 kb，G3（GliG啟動子第3輪擴增）約為4 kb（圖2）。菌液PCR篩選得到陽性克隆G1、I1、I2、O1、O2（圖3），通過與目的基因序列比對，證實均為包含目的基因啟動子片段。

圖1 GliG、GliI、GliO的表達水平

圖2 GliI、GliO、GliG染色體步移擴增得到的目的片段

將GliG、GliI、GliO三個基因的上游2-3 kb序列在啟動子預測網站（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.htmL）尋找啟動子核心區域（表2），分值相對較高（最高為1），然后擴增出這3個基因的上游區域，結果GliG基因上游500 bp，GliI基因上游700 bp，GliO基因上游300 bp（圖4）。

2.3 pGL3-basic-啟動子載體構建以及熒光素酶活性檢測

利用CPEC方法成功構建了4個分別含有GliG、GliI、GliO、pgpd核心啟動子的pGL3-Basic重組表達載體，并利用氨芐青霉素平板篩選，挑取單菌落進行菌落PCR篩選陽性克隆，測序驗證成功（圖5）。

表2 目的基因GliG、GliI、GliO啟動子核心序列

圖4 GliG、GliI、GliO、pgpd核心啟動子

將含有不同啟動子核心序列的pGL3-Basic重組載體轉化至大腸桿菌，對重組菌中的熒光素酶進行RU檢測。結果（圖6）表明，含有GliG啟動子的重組菌中熒光素酶活性遠高于其他重組菌，說明GliG核心啟動子區域具有較高的轉錄活性。

圖5 含pGL3-basic-GliG、GliI、GliO核心啟動子的菌落PCR驗證

圖6 pGL3-basic-空載/pgpd/GliG/GliI/GliO核心啟動子載體在Trans5α和BL21細胞中的熒光素酶RU值

2.4 GliG-pAN7-1質粒的構建及潮霉素抗性的驗證

用GliG核心啟動子區域替換pgpdA啟動子，構建得到重組載體，并測序成功（圖7）。將釀酒酵母均勻涂布至不同濃度的潮霉素抗性平板，發現在100 μg/mL濃度以上的潮霉素抗性平板上釀酒酵母的生長受到明顯抑制（圖8），在200 μg/mL的潮霉素平板上基本上不生長，從而確定最適宜的篩選濃度為 200 μg/mL。

圖7 2μ-pAN7-1-GliG核心啟動子載體以及trans5α菌落PCR驗證

圖8 不同濃度的潮霉素抗性平板篩選釀酒酵母

將2μ-pAN7-1-GliG核心啟動子載體以及2μ-pAN7-1載體（陽性對照）分別電轉入釀酒酵母，與陰性對照和陽性對照相比，發現在200 μg/mL的潮霉素平板上，含有2μ-pAN7-1-GliG核心啟動子載體的酵母生長較快，而且菌落數較多（圖9）。挑取含有重組載體的釀酒酵母進行菌落PCR，篩選得到陽性克隆，并通過測序得到驗證（圖10）。

圖9 2μ-pAN7-1-GliG核心啟動子電轉釀酒酵母篩選（培養3 d）

圖10 2μ-pAN7-1-GliG核心啟動子釀酒酵母菌落PCR驗證

3 討論

真菌中次級代謝產物的生物合成關鍵酶需要活性較強的啟動子來轉錄調控，尤其是對于一些關鍵限速酶，啟動子的活性對于關鍵酶的高水平表達和代謝產物的高效生物合成至關重要［13］。在絲狀真菌中許多功能性的啟動子已經應用于內源和外源蛋白的表達，例如煙曲霉屬真菌中啟動子用于異源表達人類白介素hIL-6，人血清白蛋白，人層粘連蛋白等，且產量大幅度提高［15-16］。Dolan等［5］首次對煙曲霉中膠霉毒素的生物合成基因簇及其代謝通路進行了詳細的闡述，其中GliG、GliI、GliO三個基因是膠霉毒素合成家族gli簇中不可缺少的關鍵基因，在膠霉毒素合成過程中，GliG基因編碼的谷胱甘肽S轉移酶是不可缺少的關鍵酶。目前，深海真菌D. cejpii中膠霉毒素生物合成基因的啟動子及其功能未見報道。本研究通過對該真菌中gli簇關鍵基因啟動子進行了克隆和功能預測，發現GliG、GliI、GliO啟動子對這三個基因具有轉錄活性，其中GliG啟動子的轉錄活性最強，提示該啟動子在膠霉毒素生物合成中發揮重要作用。本研究結果為分析gli簇基因家族基因的轉錄調控機制，尋找關鍵轉錄調控因子，并為后續激活D. cejpii中隱性或低活性的關鍵基因或基因簇，生物合成新型的膠霉毒素衍生物奠定基礎。同時，本研究通過對GliG基因啟動子的研究，還找到了起始轉錄GliG的啟動子序列，并能在酵母細胞中發揮作用，對潮霉素抗性基因能進行有效地起始轉錄和表達，提示該啟動子可用于表達異源或外源谷胱甘肽硫轉移酶，在醫學和臨床上具有研究和應用價值。

4 結論

本研究首次對深海真菌D. cejpii中GliG、GliI、GliO三個基因的啟動子序列進行克隆，采用熒光素酶表達載體驗證了GliG啟動子的轉錄活性，并在釀酒酵母細胞中驗證了GliG啟動子具有轉錄表達潮霉素抗性基因的功能。本研究為后期通過對D. cejpii膠霉毒素生物合成基因進行轉錄調控和異源表達獲得更多高活性的新型膠霉毒素奠定分子生物學基礎。

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