鐮刀菌Q7-31T果膠酶PGL1的分離純化、酶學性質鑒定及結構分析

秦日甜 謝占玲

（青海大學生態環境工程學院 青海省高原作物種質資源創新與利用重點實驗室，西寧 810016）

植物細胞壁是獲得生物燃料最豐富的可再生原料來源［1］。果膠是以α-1，4-糖苷鍵聯接而成的聚半乳糖醛酸天然多糖，還含鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等中性糖，產生于高等植物初級細胞壁和細胞間質內［2］。果膠作為細胞壁最復雜成分，賦予植物初生壁靈活性［3］。植物初生細胞壁中纖維素、半纖維素和果膠分別占30%、30%和35%左右［4］，果膠占植物細胞壁比重較大，但目前國內外對果膠酶的研究較纖維素酶等少。微生物果膠酶現已廣泛應用于食品工業、醫藥工業、紡織工業、造紙工業、環境領域、生物技術領域及飼料工業等領域［5］。果膠酶是真菌侵染植物細胞壁時最早分泌的酶類物質，對微生物利用天然纖維質材料起關鍵作用［6］。果膠酶主要作用于果膠類物質，降解植物細胞壁中的果膠成分，導致組織解體從而引起腐爛、枯萎等癥狀，在致病過程中有重要意義［7］。Morten等［8］研究發現一種切葉蟻分泌的果膠酶成分作用于植物細胞壁，能加速真菌對植物組織的消化。同時，果膠酶能提高纖維素酶水解的效率，可以降解細胞間質的果膠成分，而改變植物細胞壁的結構，增加纖維素酶和半纖維素酶在底物上的結合位點，進而提高酶解效率［9］。為更好地滿足工業對高效植物細胞壁降解酶的需求，對果膠酶的研究有重要意義［10］。鐮刀菌是廣泛分布在土壤和有機體內的真菌，營寄生或腐生生活，常誘發萎蔫、根腐及各型腐爛，造成農作物減產［11］。作為世界四大酶制劑之一，目前我國大部分果膠酶制劑仍需從國外進口，主要問題在于分離純化的果膠酶活性較低［12］。1999年諾維信公司便推出了用基因工程改造菌種生產的“BiPoerp”堿性果膠酶，壟斷了中國堿性果膠酶市場［13］，由于國外果膠酶研究較早、技術較成熟，我國更須加快研究進展以獲取高活力的果膠酶應用于工業化商業化等領域。田飛等［14］從青藏高原通過篩選，分離鑒定了一株能高效降解植物細胞壁的鐮刀菌菌株 Q7-31T，其粗酶液降解植物細胞壁的效率明顯高于其他菌株，經蛋白組學分析發現其含有16種糖苷水解酶類，其中1種為果膠酶，但果膠酶性質及結構等尚不清楚。為進一步研究鐮刀菌侵染植物細胞壁的作用機理，本研究以鐮刀菌 Q7-31T 為實驗材料，研究果膠酶PGL1以期對研究植物細胞壁降解機制及分離純化高活力果膠酶具有一定指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 鐮刀菌 Q7-31T 由青海大學微生物實驗室于 2007 年 5 月從青海湖地區分離得到現保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑 果膠（Pectin）、蛋白胨、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自 Sigma 公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、低分子量蛋白 Marker 購自北京索萊寶科技有限公司，Sephacry S-100、DEAE-Sepharose Fast Flow 購自 Pharmacia 公司。

1.1.3 儀器設備 數顯恒溫水浴鍋 HH-M8（上海赫田科學儀器有限公司）；TS-200 恒溫培養搖床（上海儀純實業有限公司）；250D 光照培養箱（吉特實驗儀器廠）；LDZX-40Ⅱ立式自動壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；UGP-VCY-1000-WxDxH生物超凈工作臺（統鉅凈化設備上海有限公司）；Adventurer TM 天平（奧豪斯國際貿易（上海）有限公司）；UV-9200 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；TDL-40B 型臺式低速離心機（上海安亭儀器廠）；MD44 透析袋（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株 從液體石蠟封存的菌種中挑取直徑 0.5 cm 的瓊脂塊，接種到 PDA 平板培養基（馬鈴薯 200 g，蔗糖 20 g，瓊脂 15-20 g，蒸餾水 1 000 mL）中心，25℃ 恒溫培養箱中活化 5 d；從PDA固體培養基上取1.0 cm 的菌塊轉接至液體種子培養基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨 3 g/L，Mendels 營養鹽 ：（NH4）2SO41.4 g/L、KH2PO42.0 g/L、尿素 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO45.0 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4mg/L、CoCl22.0 mg/L，pH自然，裝液量為60 mL/150 mL），60 r/min室溫振蕩培養；將液體種子按 10% 接種量轉接至產酶液體發酵培養基（燕麥秸稈 5 g/L，蛋白胨 8 g/L，Mendels營養鹽，pH 自然，裝液量100 mL/250 mL）20℃、120 r/min 振蕩培養。發酵液經8層無菌紗布過濾得粗酶液，于 4℃ 保存。

1.2.2 果膠酶活力的測定 果膠裂解酶作用于果膠的消除反應使底物生成Δ-4，5-不飽和半乳糖醛酸基，酶活性測定：取適量底物溶液和酶液迅速混合，在一定條件下反應一定時間，于235 nm下檢測吸收值，根據朗伯-比爾定律得出酶活［15］。內切、外切纖維素酶活力測定方法參見田飛、常鑫園等［14，16］研究方法。

1.2.3 蛋白含量的測定 蛋白含量的測定采用Bradford 法［17］，以牛血清白蛋白（BSA）為標準繪制標準曲線。在2 mL離心管中加入適當稀釋的蛋白樣品200 μL和1 mL考馬斯亮藍G-250染液，在595 nm下測定光吸收值。

1.2.4 硫酸銨分級沉淀 發酵液經 8 層無菌紗布過濾，得到粗酶液。將固體硫酸銨研磨細，緩慢加入粗酶液中，調節飽和度到 50%-90%，充分混勻后，4℃靜置 2 h，隨后 4℃、12 000×g離心 20 min 收集沉淀；沉淀以 pH 7-7.5 的 Tris-HCl緩沖液重懸，重懸液經透析袋（MD 透析袋，北京索萊寶科技有限公司）脫鹽，4℃ 保存備用。

1.2.5 Sephacry S-100 葡聚糖凝膠層析 硫酸銨分級沉淀后的樣品加入到 Sephacry S-100 葡聚糖凝膠層析柱（26 mm×700 mm），以 Tris-HCl 緩沖液（0.02 mol/L、pH7.0）洗脫、流速為 1.5 mL/min，用核酸蛋白檢測儀檢測蛋白的分布，DNS 法測定酶的分布（方法如前文所描述）。

1.2.6 DEAE 弱陰離子交換層析 取凝膠層析柱收集的果膠酶活性部分，吸附到pH7.0 DEAE 瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱（15 mm×50 mm）上，用含有NaCl（0.02-1.00 mol/L，pH7.0）的緩沖液進行線性梯度洗脫（1.8 mL/min），用核酸蛋白檢測儀檢測蛋白分布；樣品經 MD44 透析袋透析脫鹽后，檢測內切葡聚糖酶的分布（方法如前所述）。

1.2.7 SDS-PAGE 用SDS-PAGE 法檢測每一步實驗蛋白質分子量和分離純化過程中蛋白純度［18］。分離膠的濃度 12.5%，電泳電壓為 120 V；濃縮膠的濃度3%，電泳電壓為 80 V［19］。

1.2.8 最適溫度、pH 及穩定性測定 最適溫度測定：將底物處于 pH7.0 的緩沖溶液中，在 20-70℃進行酶促反應，之后測定果膠酶的最適反應溫度；在同上溫度水浴 30 min 后測定酶的穩定性；最適 pH 測定：將底物處于不同 pH 的緩沖液 pH1-14 在40℃條件下反應，然后測定果膠酶活力，確定最適反應pH；將樣品分別在上述 pH 處理 30 min，40℃，測定酶的 pH 穩定性。

1.2.9 底物特異性測定 分別采取濃度均為 0.5% 的果膠、羧甲基纖維素鈉、樺木木聚糖、可溶性淀粉、燕麥秸稈粉、麩皮和濾紙作為底物，酶活力測定方法參考上述內容。

1.2.10 米氏常數測定 配制不同質量濃度［S］的果膠底物溶液：10、8、6、4、2、1.5 mg/mL，加入酶液后40℃條件下反應30 min。測定外切酶活。以1/V為縱坐標，1/［S］為橫坐標作圖，1/V與1/［S］成直線關系，從而求出 Km及Vmax，Vmax=1/b，Km=a/b。1.2.11 金屬離子對酶活力的影響 酶液中分別加入各種金屬離子化合物 ：Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+等，各種金屬離子在反應體系中的終濃度達到 4 mmol/L。40℃作用 30 min 后測定果膠酶活力。沒有加入金屬離子的組酶活力作為 100%。

1.2.12 蛋白鑒定 蛋白鑒定由北京華大基因完成，具體實驗方法參照田飛、Terova等［20，21］的研究。

1.2.13 數據處理與誤差分析 采用 SPSS 19.0 數據處理軟件進行誤差分析：采用兩樣本（測定管與對照管）平均數t檢驗法進行顯著性檢驗（P＜0.01，線性相關性極顯著；0.05＞P＞0.01，線性相關性顯著；P＞0.05，線性相關性不顯著）［22］。

1.2.14 生物信息學分析 二級結構預測：應用SOPMA在線工具對果膠酶進行蛋白質二級結構的預測；疏水性/親水性分析：應用ProtScale Server對蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性進行預測；磷酸化位點預測：利用在線工具NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對蛋白質氨基酸序列進行潛在酸化位點分析；糖基化位點預測：將蛋白質氨基酸序列在丹麥技術大學生物序列分析中心的網站，使用在線預測工具NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進行預測；跨膜結構域預測：應用TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），對果膠酶氨基酸序列的跨膜結構域進行預測；功能結構域分析：InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/） 把 SWISS-PROT、EMBL、PROTSITE、PRINTS、PFAM、ProDom等數據庫提供的蛋白質序列中的結構域、motif等信息統一起來；三級結構域預測：通過Swiss-Model程序，運用同源建模法對果膠酶三級結構進行預測。

2 結果

2.1 果膠酶分離純化

果膠酶活性的蛋白樣品在硫酸銨為50%-90%的飽和度條件下沉淀下來，蛋白樣品在 Tris-HCl（0.02 mol/L，pH7.5）緩沖液中重懸，脫鹽，取 20 mL 重懸液加入到 SephacryS-100 葡聚糖凝膠柱進行分級分離，如圖1所示，有P1、P2、P3三個蛋白峰。

圖1 Sephacryl S-100凝膠過濾洗脫圖譜

對具有果膠酶酶活的蛋白樣品收集起來濃縮后上樣到DEAE 瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱上進行二次分離純化，洗脫圖譜如圖 2所示，有一個穿透峰F1 和一個洗脫峰 F2，酶活力檢測發現有明顯果膠酶活力的酶樣品主要集中在 F1 處，F2處蛋白樣品無明顯酶活力。

圖2 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換洗脫圖譜

從圖2可以看出，存在兩個洗脫峰（F1，F2），經酶活測定發現，果膠酶活主要集中在穿透峰F1處，而F2處的蛋白樣品無果膠酶活力。分別對粗酶液、硫酸銨沉淀后重懸液、經過葡聚糖凝膠柱后及DEAE瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱的蛋白進行 SDSPAGE 檢測。最終得到單一條帶，經凝膠成像系統分析，分子量為 36.21 kD 左右（圖 3）。以 800 mL發酵液開始，果膠酶PGL1從粗酶液到最后的純化產物共純化了 6.24 倍，回收率為 12.1 %，酶純化后的比活力為 62.54 U/mg，分離純化結果如表 1 所示。

圖3 分離純化蛋白的SDS-PAGE電泳圖

表1 果膠酶PGL1的純化

2.2 果膠酶酶學性質

2.2.1 最適溫度、pH 及穩定性測試 PGL1最適反應溫度、pH 及其耐受情況如圖 4-A、4-B所示，最適反應溫度為 40℃，最適反應 pH 為 8；純化的酶在 40℃下恒溫水浴 1 h 仍能維持原有酶活力的 90%以上，溫度超過 40℃ 后，酶活力開始降低，60℃水浴1 h后酶活力僅能維持原來的 45%；pH 穩定性檢測發現該酶在 pH8. 0-10. 0 范圍內可以保持 60%以上。

2.2.2 底物特異性檢測 該酶對果膠具有較高酶活力，對于微晶纖維素和植物細胞壁具有不明顯酶活力，對于羧甲基纖維素、淀粉、木聚糖和燕麥秸稈沒有降解活力（表2）。

圖4 PGL1最適溫度、最適pH和耐受性檢測

表2 PGL1底物特異性檢測

2.2.3 PGL1酶促反應中動力學參數的測定 經過Lineweaver-Burk雙倒數法，由圖5計算知PGL1降解果膠的Km值為22.35 mg/mL，Vmax為23.53 μg/（mL·min）。

2.2.4 金屬離子對酶活力影響的測定 金屬離子檢測結果（圖 6）表明，Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+等對 PGL1均有抑制作用，其中Na+、Zn2+有很明顯的抑制作用。

2.3 PGL1的鑒定

圖5 Lineweaver-Burk雙倒數曲線

圖6 金屬離子對PGL1的果膠酶活力的影響

首先對PGL1的蛋白樣品進行雙向電泳檢測結果顯示，PGL1的分子量為 36.21 kD、等電點為8.13；進行串聯質譜分析先通過一級質譜獲得蛋白的指紋圖譜（PMF），再選取有代表性的肽段，進一步破碎后進行二級質譜檢測，質譜圖如圖 7 所示。二級質譜結果結合母離子信息和 PMF 的結果進行搜庫（NCBI）比較，經Mascot搜索引擎檢索，檢索得分66分（75分為陽性），NCBI注冊號為gi︱342877242（分子量為 34.31 kD，等電點為 8.33），它們的序列相似但并不完全相同，分子量和等電點與質譜結果對應的蛋白存在差異，酶學特性顯示為果膠酶。綜合上述研究結果，將PGL1鑒定為一種新型的PL-1家族的果膠酶。

圖7 果膠酶PGL1質譜鑒定圖譜

2.4 果膠酶PGL1結構的生物信息學分析

通過對Q7-31T菌株的PGL1果膠酶進行二級結構預測、潛在磷酸化位點分析、糖基化位點預測、跨膜結構域預測、疏水性/親水性分析和三級結構的預測一系列生物信息學分析，以探究果膠酶降解相關酶系的特點和對纖維素降解機制的作用。

2.4.1 果膠酶PGL1的二級結構預測 通過SOPMA在線工具對果膠酶PGL1進行蛋白質二級結構的預測，結果如圖8。對二級結構元件進行統計分析可知：果膠酶PGL1的二級結構構成元件均為α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲四種，其中無規則卷曲和延伸鏈比例較高，分別占37.96%和31.17%；α-螺旋占20.06%；而β-轉角最少，僅占10.80%。

2.4.2 果膠酶PGL1的疏水性/親水性分析 對PGL1氨基酸序列的疏水性/親水性進行預測，負值越小表示親水性越強，正值越大表示疏水性越強，介于-0.5到+0.5之間的為兩性氨基酸。由圖9可看出PGL1的N端和C端親水性較強，而肽鏈中間部分主要表現為疏水性，可能與其空間結構與對環境的適應有關。

2.4.3 果膠酶PGL1的潛在磷酸化位點 利用NetPhos 3.1 Server對果膠酶PGL1氨基酸序列進行潛在酸化位點分析。依據分值大于0.5的氨基酸位點都是酸化位點，發現該酶在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）三個氨基酸上都具有潛在的酸化位點，結果如圖10所示。可以發現絲氨酸上的潛在酸化位點數明顯比蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化位點數高。果膠酶的磷酸位點共13個（Ser∶9；Thr∶3；Tyr∶1），相比于 Q7-31T所產的纖維素酶GH5-281和CBH-C的磷酸化位點數（45個；38個）較少［23］，說明果膠酶可能本身降解纖維素能力相對較弱，但能輔助纖維素酶更高效地降解植物細胞壁。果膠酶在植物纖維加工等方面很有應用前景［24］。

圖8 Q7-31T果膠酶PGL1二級結構預測結果圖

圖9 Q7-31T菌株果膠酶PGL1疏水性/親水性分析結果圖

2.4.4 果膠酶PGL1的糖基化位點預測 使用在線預測工具NetNGlyc 1.0 對PGL1的氨基酸序列進行糖基化位點預測，參數默認，得分大于0.5即認為為糖基化位點［25］。糖基化能增強酶蛋白對蛋白水解酶的抗性。N-糖基化能促進蛋白質的正確折疊、穩定蛋白質構象，對治療性蛋白也具有重要的藥理學意義［26］。預測結果分析可知，果膠酶PGL1存在2個潛在的N-糖基化位點，推測與其誘導合成存在很大的聯系。可能由于PGL1屬于誘導酶，其合成和加工受到鐮刀菌Q7-31T的嚴格調控等有關。

2.4.5 果膠酶PGL1的跨膜結構域預測 通過TMHMM Server v. 2.0，對Q7-31T果膠酶氨基酸序列的跨膜結構域進行預測，由預測結果可知，果膠酶PGL1不屬于跨膜蛋白，即為分泌酶，這也與PGL1分離得到的過程相一致。

2.4.6 果膠酶PGL1的功能結構域分析 應用InterProScan軟件對PGL1進行功能結構域分析結果如圖11。雖然PL-1與PL-2、PL-10家族的果膠酸裂解酶采用不同的折疊方式，但它們的催化位點呈現相似的拓撲結構、保守功能性殘基有相同的排列方式［27］。圖11預測了PGL1的功能，揭示了PGL1是降解植物細胞壁果膠層過程中的毒力因子。

2.4.7 果膠酶PGL1的三級結構預測 通過Swiss-Model程序，運用同源建模法對Q7-31T果膠酶的三級結構進行預測，如圖12所示，PGL1預測的空間構型呈中空桶狀結構，酶的比表面積大，能與底物更大程度地接觸，這可能與酶的高效降解活性存在很大的聯系。由PGL1結構與其他PL-1家族的果膠酶相比較，發現PL-1家族的果膠酶有廣泛的結構相似性，這也表明它們由相同的祖先演化而來［28］。

2.5 果膠酶對植物細胞壁降解機制的研究

研究發現，PGL1是Q7-31T誘導降解植物細胞壁最早分泌的酶，對纖維素酶降解能力有促進作用，由圖13可知，鐮刀菌Q7-31T降解植物細胞壁時存在“順序作用模型”。由蛋白組學分析［14］（表未給出）可知，果膠酶PGL1灰度覆蓋僅占糖苷水解酶的4.48%，但能在短時間內降解植物細胞壁中含量較多的果膠等物質，顯示出PGL1高效降解底物的能力。

3 討論

圖10 Q7-31T果膠酶PGL1潛在磷酸化位點分析結果圖

圖11 PGL1功能結構域分析結果圖

圖12 Q7-31T果膠酶PGL1三級結構預測結果圖

近年來國內外許多學者對微生物果膠酶生產菌株的篩選、育種、鑒定、發酵、酶的分離純化與酶學性質及酶的分子生物學特性與應用等方面進行了大量的研究［5］，根據 2001 年 Kashyap 等［29］研究報道，果膠酶占世界食品酶中25%的銷售額，而目前我國由于對果膠酶研究較晚、實驗技術較落后和酶系信息的不完善等導致果膠酶制劑大多依賴于國外進口。本研究分離純化了具有高活力的果膠酶PGL1，得到了Q7-31T降解植物細胞壁的“順序作用模型”，并對PGL1進行了生物信息學分析。這對植物細胞壁降解機制提供一定的理論支持，且能提供分離純化高活力果膠酶的實驗方法，進一步完善鐮刀菌屬酶系信息。本實驗分離純化得到果膠酶PGL1，從粗酶液到最后的純化產物共純化了 6.24 倍，回收率為 12.1%，比徐偉等［30］純化重組菌Escherichia coliBL21/pET-pel表達的果膠酶純化倍數（1.71）更高。許多果膠酶均為Ca2+依賴型，而本研究發現Ca2+對PGL1有抑制作用。有研究表明PL-1 家族酶的結構不需要金屬陽離子，因為其底物中大多羧酸基團都是甲基酯化的［31］。PGL1的β-轉角最少，僅占10.80%，而Kamen等［32］研究的pelC二級結構中β-轉角占最大比例（30%）。

圖13 不同發酵時間下果膠酶和內、外切酶活變化情況

果膠酶是參與植物細胞壁降解的重要的酶，利用β-消除機制降解果膠，能造成植物組織的斷離［20］。果膠酶是植物病原菌所必不可少的，而從青藏高原分離得到的植物病原菌Q7-31T對植物細胞壁降解具有高效性。致病菌分泌的果膠酶降解植物細胞壁是使植物通過各種誘導因子的檢測來識別病原體的攻擊，果膠裂解酶還可以通過釋放引起植物先天免疫的寡聚物間接地激活植物的防御系統［33］。圖11 也預測了PGL1 的功能， 揭示了PGL1 是降解植物細胞壁果膠層過程中的毒力因子，這與Mayans O. 等人從Aspergillus 得到的果膠酶A具有相似功能［34］，當果膠主鏈被甲基化時，通過果膠裂解酶（微生物毒力因子）來切割。果膠裂解酶具有裂解果膠并在其非還原末端通過4-脫氧-α-D-甘露糖-4-烯醛酸糖基產生低聚糖的作用。本實驗從鐮刀菌Q7-31T中分離純化得到一種具有高活力高回收率的新型PL-1家族果膠酶PGL1并對其進行了生物信息學分析，完善了鐮刀菌屬Q7-31T酶系信息、進一步提供了對植物細胞壁降解的作用機制信息，本研究的方法等也能為我國酶制劑的高活力生產提供一定的理論支持。

4 結論

本研究以0.8 % 蛋白胨為氮源，0.5% 燕麥秸稈為碳源誘導發酵培養鐮刀菌Q7-31T；采用Sephacry S-100 凝膠柱層析和 DEAE 瓊脂糖弱陰離子交換柱層析對粗酶液進行分離純化得到果膠酶PGL1；對其進行了酶學性質分析和串聯質譜鑒定，結果表明：PGL1分子量為36.21 kD，等電點為8.13；PGL1最適反應溫度為40℃，最適反應 pH 為8；在20℃ 到50℃ 和pH 8.0到10.0能保持較高穩定性；Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+和Fe2+對PGL1有抑制作用；串聯質譜鑒定表明該蛋白為一種新型PL-1家族果膠酶；最后通過生物信息學分析結構及預測功能：PGL1二級結構構成元件中主要為無規則卷曲和延伸鏈，分別占37.96%和31.17%；PGL1兩端親水性強而中部疏水性強；磷酸化位點共13個（Ser∶9；Thr∶3；Tyr∶1）；PGL1存在2個潛在的N-糖基化位點；跨膜結構域預測顯示其為分泌酶；功能結構域預測出其為植物細胞壁降解的毒力因子。

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