MTA3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

周 薏 傅志泉 朱 樑

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中病死率最高的1種，在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌。

腫瘤轉(zhuǎn)移基因(metastasis associated gene,MTA)家族是一類重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的抑制因子，主要包括MTA1、MTA2、MTA3及一些類似分子，其主要功能為參與組蛋白去乙酰基酶(nucleosome remodeling deacetylase，NuRD)復(fù)合物的合成，并且可以通過調(diào)節(jié)雌激素通路、細(xì)胞骨架和細(xì)胞凋亡等途徑促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，MTA家族在高轉(zhuǎn)移乳腺癌、肺癌、肝癌等癌癥組織中均有表達(dá)[2-6]，且與這些腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān) 。其中MTA3被報(bào)道在不同腫瘤中表達(dá)不同從而發(fā)揮著重要的作用[7-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)MTA3在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上升，在不同肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)也顯著上調(diào)。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)進(jìn)一步探討干擾 MTA3的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。本實(shí)驗(yàn)一方面揭示了MTA3的調(diào)控機(jī)制，另外一方面為后期MTA3是否可能作為一個(gè)潛在的肝細(xì)胞癌治療基因靶點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本獲取、細(xì)胞株和主要試劑

20份肝細(xì)胞癌和癌旁樣本取自上海市長(zhǎng)征醫(yī)院普外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的肝癌患者。所有患者術(shù)前均未接受放化療，臨床病理資料和隨訪記錄完整。收集患者術(shù)后肝癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織(距癌組織邊緣≥5 cm)標(biāo)本。研究方案經(jīng)上海市長(zhǎng)征醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬簽署知情同意書。

人正常肝細(xì)胞株L02和人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7、Hep3B(上海吉滿生物科技有限公司)。

MTA3兔抗人單克隆抗體(購自英國Abcam公司)； Cell Counting Kit-8試劑盒(Sigma-Aldrich Co.)； MTA3 siRNA及陰性對(duì)照由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR 細(xì)胞提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green法，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，總體積20 μl。擴(kuò)增過程如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參。基因相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算方式如下：ΔCt=Ctgene-Ctreference，增加倍數(shù)用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。每次試驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)孔。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 采用免疫組化EnVision二步法檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織中 MTA3的表達(dá)和分布。石蠟包埋組織5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟和水化；切片入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)，于微波爐內(nèi)抗原修復(fù)20 min，室溫冷卻后PBS漂洗；3 % H2O2封閉10 min，PBS漂洗；加入MTA3兔抗人單克隆抗體(1∶150)4 ℃過夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃ 孵育1 h；PBS漂洗，DAB顯色，自來水洗滌，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞株L02和人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7、Hep3B培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.4 siRNA干擾效率檢測(cè) siRNA序列如下：siRNA-1:5’-CAGUGUAGAUUAUGUGCAATT-3’；siRNA-2:5’-AGAUAAGCAUGCUAAAGAATT-3’。分別將其轉(zhuǎn)染HepG2，Huh7，Hep3B細(xì)胞，48 h收細(xì)胞提取RNA用于定量PCR檢測(cè)MTA3表達(dá)確定干擾效率。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2和Huh7細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次，每孔先加入無血清培養(yǎng)基100 μL，再分別轉(zhuǎn)染MTA3 siRNA或?qū)φ誷iRNA，輕搖混勻后于培養(yǎng)箱中靜置6 h，棄上清，加入含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，最終測(cè)定OD450。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2和Huh7細(xì)胞以3×103/皿接種于3.5 cm的細(xì)胞皿中，37 ℃，CO2溫育兩周，1%結(jié)晶紫染色后計(jì)集落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MTA3在肝細(xì)胞癌和癌旁組織、及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：肝細(xì)胞癌組織中的MTA3表達(dá)明顯高于癌旁組織，P<0.01(圖1A)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：MTA3在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平也是明顯升高的。除此之外，通過定量PCR檢測(cè)正常人肝細(xì)胞株L02和人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7、Hep3B中MTA3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)除了Hep3B中MTA3的表達(dá)相對(duì)于正常組無顯著差異，其余兩組(HepG2、Huh7)中MTA3的表達(dá)水平相對(duì)于正常組顯著升高，P<0.01(圖1B)。

2.2 siRNA干預(yù)MTA3表達(dá)效果檢測(cè)

構(gòu)建兩個(gè)MTA3的干擾siRNA-1/2，分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞之后通過定量PCR檢測(cè)其對(duì)MTA3表達(dá)的抑制效果，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)siRNA干擾組相比于對(duì)照組都具有顯著差異，P<0.01，說明干擾siRNA構(gòu)建成功，干擾效率均在50 %左右(圖2)。

2.3 干擾MTA3后肝癌細(xì)胞株增殖情況

肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7中通過siRNA-1/2干擾MTA3之后發(fā)現(xiàn)相比于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，干擾MTA3后細(xì)胞增殖減慢，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，OD450吸光值的變化(圖3A、B)。除此之外，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2和Huh7細(xì)胞在干擾MTA3后克隆形成數(shù)量顯著減少，說明細(xì)胞增殖受到顯著抑制(圖3C、D)。

3 討論

MTA3作為一類腫瘤轉(zhuǎn)移基因，在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，之前的研究結(jié)果顯示MTA3在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中低表達(dá)[7,11-15]，在子宮非內(nèi)膜樣腺癌中MTA3可以作為一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)；MTA3在肺癌組織中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)MTA3能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、還能通過調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)來抑制肺瘤細(xì)胞的凋亡[10,16-18]。MTA在HCC組織中的表達(dá)情況根據(jù)onco mine數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)，共有2個(gè)研究數(shù)據(jù)包含MTA3的表達(dá)情況：2007年Hepatology發(fā)表的35例HCC和10例正常肝組織的MTA表達(dá)對(duì)比；2002年Mol Biol Cell發(fā)表的103例HCC和75例正常肝組織的MTA表達(dá)對(duì)比，綜合兩個(gè)研究結(jié)果，相比于正常肝組織，MTA3在138例HCC中表達(dá)顯著上調(diào)，P<0.05[19-20]。我們?cè)趏ncomine數(shù)據(jù)庫中檢索到的這兩個(gè)相關(guān)研究指出，MTA3在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，可能參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，將來可能作為1個(gè)潛在的肝細(xì)胞癌藥物治療靶點(diǎn)。

圖1 MTA3在肝癌、癌旁組織及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

圖2 siRNA干預(yù)MTA3表達(dá)效果

圖3 干擾MTA3后顯著抑制人肝癌細(xì)胞株增殖

納入的肝細(xì)胞癌臨床樣本檢測(cè)顯示MTA3在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著上升，這和數(shù)據(jù)庫中檢索到的資料結(jié)果相符合。之后我們檢測(cè)了MTA3在各種人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于人正常肝細(xì)胞株，MTA3的表達(dá)顯著上升，說明在肝細(xì)胞癌變的過程中MTA3的表達(dá)是上升的，接下來我們構(gòu)建了兩個(gè)siRNA成功干擾了MTA3在人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)MTA3的表達(dá)能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞株的增殖，這可能說明MTA3在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，并且很有可能成為潛在的藥物治療靶點(diǎn)。我們的研究一方面揭示了MTA3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，另一方面初步探討了其在肝癌細(xì)胞增殖過程中的調(diào)控作用，為后期的研究提供了基礎(chǔ)。

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