利用不依賴連接反應(yīng)的克隆方法構(gòu)建pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP表達(dá)載體

王培培， 韓 榕

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西 臨汾 041000； 2.植物分子與環(huán)境脅迫響應(yīng)山西省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 臨汾 041000)

克隆是目前最常用的一種研究基因功能的方法。傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物克隆方法主要有2種：黏性末端連接[1]和平末端連接[2]。平末端連接方式操作相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)需經(jīng)過(guò)多次酶切，但是克隆成功率較低。傳統(tǒng)的克隆方法看似簡(jiǎn)單，但試驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作過(guò)程比較繁瑣，在設(shè)計(jì)引物時(shí)目的片段酶切位點(diǎn)的選擇有時(shí)受載體上酶切位點(diǎn)的限制，并且這種方法僅適合于克隆單個(gè)基因。在多數(shù)實(shí)際研究中，構(gòu)建重組載體時(shí)會(huì)受到載體序列上酶切位點(diǎn)的限制，尤其是多個(gè)目的基因片段與載體的重組更容易受到傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法不足的影響[3]。因此，開(kāi)發(fā)新的簡(jiǎn)便快速高效構(gòu)建載體的方法很有必要。

Aslanidis等[4]在1990年首次提出了不依賴連接反應(yīng)的克隆(Ligation-independent cloning, LIC)方法。這種克隆方法不受酶切位點(diǎn)的限制，任何基因的片段都可以克隆到載體上，而且無(wú)需使用連接酶和內(nèi)切酶，連接效率高，實(shí)驗(yàn)操作也簡(jiǎn)便。

微管結(jié)合蛋白MAP65-1和MAP65-2是植物MAP65蛋白家族中的成員，與酵母中的Ase1家族及脊椎動(dòng)物中的PRC1家族同源[5-6]。Chang-Jie等[7]用生化方法從煙草(Nicotianatabacum)BY-2細(xì)胞中最先發(fā)現(xiàn)了微管結(jié)合蛋白，并命名為MAP65，該蛋白質(zhì)能使微管成束。隨后Hussey等[8]發(fā)現(xiàn)在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中也存在MAP65家族的成員。目前對(duì)模式植物擬南芥中MAP65-1研究較多，因?yàn)閿M南芥基因組小，生長(zhǎng)周期短，利于遺傳轉(zhuǎn)化。AtMAP65-2與AtMAP65-1有78%生物序列相似性[9]。AtMAP65-1蛋白質(zhì)在整個(gè)細(xì)胞周期都有表達(dá)，并且與有絲分裂的紡錘體和成膜體微管的形成有關(guān)[6,9-10]。AtMAP65-1可以促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定已聚合的微管，AtMAP65-2不參與微管的裝配與成核，但在低溫下MAP65-2比MAP65-1更能穩(wěn)定已聚合的微管[11-12]。在本實(shí)驗(yàn)室初期的研究中發(fā)現(xiàn)UV-B輻射后小麥的根尖產(chǎn)生異常有絲分裂[13]，推測(cè)UV-B輻射后MAP65-1和MAP65-2蛋白質(zhì)的豐度或者亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，進(jìn)而使微管不能成束，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致紡錘體在多方向上發(fā)生牽拉作用使染色體產(chǎn)生聚集或排斥。本研究運(yùn)用不依賴于連接反應(yīng)的克隆(Ligation-independent cloning, LIC)方法構(gòu)建pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP表達(dá)載體，為后續(xù)研究UV-B輻射下MAP65-1和MAP65-2在細(xì)胞中的定位及在有絲分裂各時(shí)期的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選用野生型擬南芥(Col型)，種子先用1%次氯酸鈉消毒12 min，再用滅菌的蒸餾水沖洗5次，然后用 0.1% 的瓊脂粉水懸浮種子，點(diǎn)種在MS培養(yǎng)基上，4 ℃低溫放置3 d后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室中。生長(zhǎng)室的溫度為(22±1) ℃，光照度為 5 500～6 500 lx，光周期為16 h∶8 h(光∶黑暗)，相對(duì)濕度為70%。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及試劑 大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室所有。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA聚合酶Exon3酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA切膠回收試劑盒、DNA marker 均購(gòu)自TaKaRa(Japan)公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB(Beijing)公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 取在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)9 d的擬南芥幼苗，將幼苗轉(zhuǎn)移到液氮中，用預(yù)冷的研棒將葉片研磨成粉狀。使用Trizol試劑提取RNA后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。RNA質(zhì)量合格后，使用PrimeScipt? RTReagent Kit(TaKaRa公司產(chǎn)品)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后將cDNA儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2MAP65-1和MAP65-2基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)擬南芥微管結(jié)合蛋白基因MAP65-1和MAP65-2的CDS序列全長(zhǎng)及表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。使用TaKaRa Biotechnology公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶進(jìn)行MAP65-1和MAP65-2基因片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(10 μl)：1 μl cDNA，1 μl引物，5 μl Primerstar，3 μl H2O。PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增出特異性條帶，然后放大到50 μl體系中進(jìn)行擴(kuò)增，使用PCR產(chǎn)物切膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收。使用BamH I、SalI雙酶切pCHF3-YFP載體，電泳檢驗(yàn)酶切結(jié)果。

表1MAP65-1和MAP65-2基因片段的克隆引物

Table1MAP65-1andMAP65-2geneprimersforcloningofthefragment

引物 序列MAP65?1?FP5′?GAGCTCGGTACCCGGATGGCAGTTACAGATACTGAAAGTC?3′MAP65?1?RP5′?GCCCTTGCTCACCATTGGTGAAGCTGGAACTTGATG?3′MAP65?2?FP5′?GAGCTCGGTACCCGGATGGCAGTGACAGAAGCAGAAA?3′MAP65?2?RP5′?GCCCTTGCTCACCATCGGTGAAGCCATCACTGGG?3′

下劃線部分為與載體同源的30 bp DNA片段。

用LIC方法將MAP65-1和MAP65-2基因克隆到pCHF3-YFP載體中?？寺◇w系：MAP65-1或MAP65-2基因1.5 μl，pCHF3-YFP載體2.0 μl，10×Exon3 buffer 1.0 μl，H2O 5.5 μl，冰浴5 min后加入1 μlExon3酶(20 U)，再冰浴1 h后加入1 μl 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)終止反應(yīng)，然后進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，涂鹽酸壯觀霉素(Spec)抗性LB培養(yǎng)基平板，第2 d即可見(jiàn)菌落長(zhǎng)出。將菌落進(jìn)行PCR鑒定。將PCR驗(yàn)證成功的pCHF3-MAP65-1-YFP菌落、pCHF3-MAP65-2-YFP菌落分別用SacI和SmaI進(jìn)行酶切鑒定。將酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送到北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 擬南芥RNA的提取結(jié)果鑒定

用Trizol試劑提取擬南芥幼苗RNA，提取完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果(圖1)顯示3條清晰的條帶，說(shuō)明RNA完好，沒(méi)有發(fā)生降解。

2.2 MAP65-1和MAP65-2基因的擴(kuò)增

以擬南芥RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用目的基因的上下游引物，并采用Primerstar高保真防突變酶，擴(kuò)增MAP65-1和MAP65-2基因。擴(kuò)增的MAP65-1和MAP65-2基因大小分別約為1 764 bp和1 737 bp(圖2)。

M：Marker；1～3：RNA。圖1 擬南芥幼苗總 RNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis diagram of the total RNA of Arabidopsis thaliana seedlings

M：DNA Marker；1、2：MAP65-1基因;3、4：MAP65-2基因。圖2 MAP65-1和MAP65-2基因RT-PCR電泳圖Fig.2 The agarose gel electrophoresis diagram of MAP65-1 and MAP65-2 with RT-PCR

2.3 pCHF3-YFP載體的酶切

使用BamH I和SalI雙酶切pCHF3-YFP載體，酶切后電泳結(jié)果顯示載體被切成線性載體(圖3)。切膠回收產(chǎn)物，測(cè)得回收后產(chǎn)物濃度為25 ng/μl。

M：DNA maker；1：pCHF3-YFP載體；2：雙酶切后的pCHF3-YFP載體。圖3 pCHF3-YFP載體酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.3 The agarose gel electrophoresis diagram of pCHF3-YFP vector with enzyme digestion verification

2.4 目的基因和載體的重組轉(zhuǎn)化

將MAP65-1和MAP65-2目的基因的PCR產(chǎn)物和酶切后的線性載體用LIC方法連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。取培養(yǎng)物涂布于Spec抗性平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h后平板上長(zhǎng)出單菌落，挑取部分單菌落接種至新的鹽酸壯觀霉素LB固體培養(yǎng)基上。以單菌落為模板，用目的基因引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將驗(yàn)證正確的單菌落從培養(yǎng)基上接種到Spec液體LB培養(yǎng)基中活化，活化之后提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒用SacI和SmaI雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示3條帶(約12 000 bp、815 bp、520 bp)，驗(yàn)證正確。

M為DNA maker；A、B圖中1～9為抗性平板上挑取的單菌落；C圖中1和3是pCHF3-YFP質(zhì)粒，2是Sac I和Sma I酶切后的pCHF3-MAP65-1-YFP質(zhì)粒，4是Sac I和Sma I酶切后的pCHF3-MAP65-2-YFP質(zhì)粒。圖4 pCHF3-MAP65-1-YFP菌落PCR(A)及pCHF3-MAP65-2-YFP菌落PCR(B)和酶切驗(yàn)證(C)電泳圖Fig.4 The agarose gel electrophoresis diagram of the pCHF3-MAP65-1-YFP(A) and the pCHF3-MAP65-2-YFP (B) colony verification with RCR and these enzyme digestion verification(C)

2.5 重組質(zhì)粒pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP測(cè)序結(jié)果比對(duì)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒，將酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送到北京華大基因公司測(cè)序。測(cè)序后，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示序列正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用LIC技術(shù)構(gòu)建載體，不僅簡(jiǎn)便、快捷而且連接效率高。常規(guī)酶切連接方法操作過(guò)程繁瑣，需與多個(gè)中間載體連接，連接效率很低，而且篩選重組子的工作量很大，而采用LIC方法可以減少連接、轉(zhuǎn)化次數(shù)，快速地篩選到所需構(gòu)建載體。LIC技術(shù)目前在很多方面都得到了廣泛應(yīng)用，例如在目的基因克隆、蛋白質(zhì)融合表達(dá)等方面[14-15]。Stols等[1]利用LIC的原理首次成功構(gòu)建了攜帶有His標(biāo)簽的表達(dá)載體pMCSG7，目前被用于大規(guī)模靶基因克隆和表達(dá)。Donnelly等[16]將載體pMCSG7的TEV蛋白質(zhì)酶識(shí)別位點(diǎn)上游加上一個(gè)MBP標(biāo)簽，這樣該載體表達(dá)的蛋白質(zhì)就能被酶切，除去標(biāo)簽從而得到所需的蛋白質(zhì)。Tan等[17]利用LIC技術(shù)成功構(gòu)建了含有6His-tag、TEV、NBbvCIA識(shí)別位點(diǎn)以及Swa I位點(diǎn)的pET30a-LIC載體，此載體可快速地篩選出可溶蛋白質(zhì)和表達(dá)蛋白質(zhì)。隨后Cabrita等[18]和Dan等[19]將包含有MBP、GST等其他親和融合標(biāo)簽的LIC表達(dá)載體列入基因組計(jì)劃。Eschenfeldt等[20]構(gòu)建了15個(gè)LIC載體，將MBP、GST親和融合標(biāo)簽用于高通量克隆和改善表達(dá)蛋白質(zhì)的可溶性。LIC技術(shù)加快了載體構(gòu)建的進(jìn)程，尤其是提高了連接效率[21]。

在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)，用一定劑量的UV-B輻射小麥時(shí)，小麥根尖體細(xì)胞中染色體發(fā)生了異常分裂[14]，推測(cè)這種現(xiàn)象的產(chǎn)生原因是UV-B輻射破壞了細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紡錘體在多個(gè)方向上發(fā)生牽拉作用使染色體聚集或排斥。而MAP65-1和MAP65-2是一類微管結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠使微管成束，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，所以進(jìn)一步推測(cè)UV-B照射后MAP65-1和MAP65-2蛋白質(zhì)豐度或者亞細(xì)胞定位發(fā)生改變進(jìn)而導(dǎo)致微管結(jié)構(gòu)破壞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究利用LIC技術(shù)成功快速地構(gòu)建了pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP表達(dá)載體，為后續(xù)研究試驗(yàn)提供了材料。

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