miR-27a與SCF 靶向關系鑒定

趙園園， 孟金柱

(銅仁學院烏江學院，貴州 銅仁 554300)

miRNAs 通常都是通過與靶基因 mRNAs 按序列配對的方式結合來抑制靶基因的表達，由于堿基種類少，種子序列個數少(約 8 個堿基)，所以出現同樣序列的概率極高，因此 miRNAs 與 mRNAs 的配對是“一對多，多對一”的方式[1]，因此 miRNAs 的生物學功能極其復雜。探究 miR-27a 與 干細胞因子(SCF) 的靶向關系，有助于通過已知的 SCF 的功能，推測和探究 miR-27a 生物學功能，為 miR-27a 功能的研究開辟新方向。研究結果表明，miR-27a 參與多種細胞的增殖分化、凋亡,血管生成,黑色素生成,脂肪形成等生物學過程[2-7]。還與多種癌癥(乳腺癌、胃癌和宮頸癌等)的發生、發展和預后密切相關[8-11]。而SCF通過與 c-kit 結合參與造血干細胞、生殖細胞、黑色素細胞和肥大細胞的遷移、存活及增殖等生物學過程[12]。隨著越來越多的 miRNAs 被發現，miRNAs 功能的研究及其作用機理的探究越來越受到人們的關注，miRNAs 不編碼蛋白質，是通過作用于靶基因來發揮作用的，因此，尋找 miRNAs 的靶基因尤其關鍵。研究者發現，在淺色哺乳動物皮膚中 miR-27a 表達量顯著高于深色皮膚[7, 13]，因此，推測 miR-27a 可能作用于促進黑色素生成的基因，而SCF在黑色素生成中通過與 c-kit 結合發揮促進作用，因此，本試驗假設SCF基因是 miR-27a 的靶基因之一。利用生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因檢測系統等，驗證miR-27a 與SCF之間是否存在靶向關系，為進一步探究和完善miR-27a的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗所用 C57BL/6 小鼠和 HEK 293 T 細胞及 pMSCV 和 pmirGLO 載體均來自山西農業大學羊駝生物工程實驗室，分別選 2 月齡的棕色和灰色小鼠各3只，取皮膚組織，用于提取總 RNA，同時收集鼠尾，用于提取基因組 DNA。

本試驗所用的 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time) kit 和 SYBR? PrimeScriptTMⅡ RT-PCR Kit 以及限制性內切酶均購自大連寶生物公司，Site-Directed Gene Mutagenesis Kit 購自上海碧云天生物技術有限公司，DMEM 培養基購自 Gibco 公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，轉染試劑 lipofectamine 2000 reagent 購自 Invitrogen 公司，雙熒光測定試劑盒 Promega Dual Luciferase Assay Kit 購自 Promega 公司。

1.2 總RNA提取和qRT-PCR

本試驗中總 RNA 提取采用 TRIzol 法，設計并合成 miR-27a 和SCF的引物(表1)，分別以18S和U6為看家基因。反轉錄用 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time) kit，熒光定量 PCR 用 SYBR? PrimeScriptTMⅡ RT-PCR Kit，每次試驗進行 4 次重復。

1.3 靶基因預測

在 PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (http://www.targetscan.org/) and DIANA-microT (http://www.microrna.gr/microT) 3個數據庫中對 miR-27a 的靶基因進行預測。

1.4 載體構建

從 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索小鼠pri-miR-27a 序列(NR_029746.1)，在此基礎上，從 UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中搜索其上下游各延伸 100 bp 的序列，以此為參考，設計引物(表1)，并在上下游引物的5′端分別加上XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點序列和保護堿基，以小鼠基因組 DNA(酚氯仿法提取)為模板進行 PCR 擴增，將產物克隆到 pUC-T 載體上，分別用XhoⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶對 pUC-T 載體和 pMSCV PIG 載體進行雙酶切，純化產物，T4 連接酶 16 ℃過夜連接，構建重組載體 pMSCV-pri-miR-27a，經轉化、LB 固體培養基培養、液體培養基搖菌，質粒提取(去內毒素)，獲得大量重組質粒，測序鑒定重組效果，-80 ℃保存備用。

從 NCBI 中搜索小鼠SCF3′UTR 序列(NM_013598.2)，設計引物(表1)擴增包含 miR-27a 結合位點的片段，以小鼠 cDNA(TRIzol 法提取)為模板，上下游引物的5′端分別加上SacⅠ和XbaⅠ酶切位點序列和保護堿基，將pUC-T 載體和 pmirGLO 載體進行雙酶切、重組、測序，最后獲得 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR，-80 ℃保存備用。

1.5 構建突變載體

以 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 為模板，設計結合位點4個連續堿基突變的引物(表1)，用Site-Directed Gene Mutagenesis Kit 進行突變，將突變過的載體轉化、培養，提取質粒，測序，最終保留突變成功的載體，即為 pmirGLO-SCF-mut-3′UTR。

1.6 細胞培養及轉染

HEK 293 T 細胞為實驗室保存，培養在添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中。轉染分3組進行：pMSCV-pri-miR-27a + pmirGLO-SCF-wt-3′UTR，pMSCV-pri-miR-27a + pmirGLO-SCF-mut-3′UTR，pMSCV NC(空載體)+ pmirGLO-SCF-wt-3′UTR。轉染比例：24孔細胞培養板每孔150 μg pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 或 pmirGLO-SCF-mut-3′UTR + 250 μg pMSCV-pri-miR-27a 或 pMSCV NC(空載體)。轉染 48 h后，收集細胞，用 Promega Dual Luciferase Assay Kit 處理，用 GLOMAXTM 96 Microplate Luminometer 測定熒光活性。

表1所有引物序列及用途

Table1Primersusedinthisstudy

引物名稱 引物序列(5′→3′) 用途SCFFGTCATTGTTGGCTACGAGARealtimePCRSCFRCACGAGGTCATCCACTATTTTRealtimePCRSCF3′UTRFCGAGCTCTGTTACCTTCGCACAGTGGCLuciferasereporter?wtSCF3′UTRRGCTCTAGAGCTCCACCGCATGGATAGAALuciferasereporter?wtSCF?3′UTR?mutFGGAGCAGAGTGCTTCGCACACAACCCTGCACTGAATTALuciferasereporter?mutSCF?3′UTR?mutRTAATTCAGTGCAGGGTTGTGTGCGAAGCACTCTGCTCCLuciferasereporter?mutmiR?27aFACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGRealtimePCRUniversalPrimerTGGTGTCGTGGAGTCGRealtimePCRU6FCTCGCTTCGGCAGCACARealtimePCRU6RAACGCTTCACGAATTTGCGTRealtimePCRmiR?27aRCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACTRealtimePCRMir?27aF?XhoⅠAAGCTCGAGCTGTCGCCAAGGATGTCTGTPCR?CloneMir?27aR?EcoRⅠGGAATTCAGGAGGCAGAGCAGGGTGPCR?Clone18S?FCTAAGGAGAAGGGCCAGTCCRealtimePCR18S?RCTCAAGTTGGGGGACAAAAARealtimePCR

1.7 數據分析

熒光定量 PCR 數據采用 2-△△Ct計算法，熒光活性值 = 螢火蟲熒光值 / 海腎熒光值，最終數據分析均用 SPSS 軟件進行，數據用平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 miR-27a 和 SCF 的表達量

根據熒光定量 PCR 的結果，miR-27a 在灰色小鼠皮膚中的表達量極顯著高于棕色小鼠(P<0.01)；而SCF在棕色小鼠皮膚中的表達量顯著高于灰色小鼠(P<0.05)(圖1)，這種相反的表達趨勢說明 miR-27a 與SCF可能存在靶向關系，并且 miR-27a 可能抑制黑色素生成。

**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。圖1 miR-27a 和 SCF 分別在棕色和灰色小鼠皮膚中的表達量Fig.1 Expression of miR-27a and SCF mRNA in brown and gray mouse skin

2.2 載體重組及突變

經測序發現，小鼠 pri-miR-27a 和SCF3′UTR 分別成功重組到 pMSCV PIG和pmirGLO載體上，插入片段分別為186 bp和658 bp，并且測序結果與 NCBI 上的參考序列完全一致，無突變、變異等，可用于后續研究。同時，載體成功突變，與野生型相比，存在 4 個連續堿基的突變，即位于SCFcDNA 1 202～1 205 bp 的 TGTG 突變為 ACAC，與引物設計時的突變堿基的位置和種類一致，可用于后續研究。

2.3 靶基因預測

通過3個數據庫的分析發現，SCF是 miR-27a 的靶基因，并且結合位點位于SCFcDNA的1 200 ～1 207 bp，并且物種間序列保守(圖2)。

圖2 SCF 3′UTR上miR-27a的結合位點、突變位點及物種間的保守性Fig.2 The binding site and mutation site of miR-27a on the SCF 3′UTR and the conservatism across different species

2.4 細胞培養及轉染

通過觀察發現，HEK 293 T細胞生長良好，轉染 48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察細胞，結果(圖3)顯示，綠色熒光蛋白表達良好，視野內熒光密度及廣度都很好，說明轉染效果良好，可用于測定雙熒光活性。

A為共轉染 miR-27a 過表達載體和SCF 3′UTR 雙熒光報告載體的 HEK 293 T 細胞(×100)白光照片； B為共轉染 miR-27a 過表達載體和SCF 3′UTR 雙熒光報告載體的 HEK 293 T 細胞(×100)熒光照片。圖3 轉染效率Fig.3 Transfection efficiency

2.5 雙熒光活性

2種質粒共轉染 HEK 293 T細胞 48 h 后，收集細胞，測定細胞中的螢火蟲熒光和海腎熒光的活性值，其比值即為熒光活性，結果顯示，共轉 pMSCV-pri-miR-27a和 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 的細胞中，熒光活性值為 7.38±0.43，而其他兩組分別為 13.18±2.06和 12.97±1.65，熒光活性下降約 44%，下降效果顯著(P<0.05)(圖4)。

a:pMSCV+SCF-3′UTR wt;b:pMSCV-miR-27a+SCF-3′UTR wt;c:pMSCV-miR-27a+SCF-3′UTR mut。*表示差異顯著(P<0.05)。圖4 3組轉染中的相對熒光值Fig.4 Relative luciferase value in three groups

3 討 論

miRNAs 是短片段 RNA，通常只有18～25 nt，不能編碼蛋白質，通過與靶基因 mRNAs 3′UTR或 5′UTR 的不完全匹配抑制 mRNAs 翻譯成蛋白質或通過降解 mRNAs 發揮抑制作用[1, 14-18]。隨著研究的深入，人們還發現一些 miRNAs 也可以與靶基因的 CDS 區結合來發揮作用[19]。本研究中，miR-27a 就是與靶基因SCF的3′UTR 結合的，miRNAs 對靶基因有抑制作用，因此其在組織細胞中的表達趨勢可能是相反的，而本研究中 miR-27a 與SCFmRNA 在不同顏色小鼠的皮膚中的表達趨勢正是呈現這種相反的現象，這就為我們的假設提供基礎。

miRNAs 與其靶基因的靶向關系的確定主要通過2種方法，一種是生物信息學預測，另一種是試驗驗證，二者結合，效果最佳。生物信息學預測通常是基于種子序列的互補配對、保守性、自由能及結合位點的開放性等[20]。試驗驗證也主要為雙熒光報告試驗和過表達/敲除試驗，前者從序列配對層面進行驗證，后者從生物學功能層面進行驗證。

本研究利用3個 miRNAs 數據庫進行生物信息學預測，因3個數據庫的算法略有差異[20]，保證了預測的準確性，結果顯示，SCF是 miR-27a 的靶基因，并且結合位點(種子序列)位于SCFmRNA 3′UTR，這符合 miRNAs 作用于靶基因的原理，同時為我們的假設提供了理論依據。

最后，通過構建 miR-27a 的過表達載體及靶基因SCF3′UTR 的雙熒光報告載體，并將其共同轉染 HEK 293 T 細胞，測定熒光活性，從而確定miR-27a 與SCF之間的靶向關系。這一試驗是從序列匹配方面對 miRNAs 與靶基因的匹配關系進行驗證，其原理是：當過表達載體表達的 miRNAs 與雙熒光報告載體上的靶基因 3′UTR 序列配對并結合時，就阻斷雙熒光報告載體上螢火蟲熒光蛋白的表達，從而使熒光活性降低。

研究結果表明， miR-27a 參與細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發生等多種生物學過程。miR-27 促進胎兒成骨細胞增殖，內皮細胞增殖，血管生成，抑制脂肪細胞的分化和脂肪形成，也促進小鼠黑色素生成[2-7]。此外，miR-27a 還與多種癌癥的發生、發展和預后密切相關，如乳腺癌、胃癌和宮頸癌等[8-11]。研究結果表明 miR-27a-3p 與 Wnt3a 在不同毛色的小鼠皮膚中也表現出完全相反的表達趨勢[7]。除此之外，本課題組之前在羊駝上的研究結果也表明，miR-27a-3p 在白色羊駝皮膚中的表達量是棕色羊駝皮膚中的5.99倍[13]，因此，推測 miR-27a 在黑色素生成過程中可能發揮抑制作用。

通過與 c-kit 結合，SCF可以間接影響黑色素細胞的遷移、增殖及存活等生物學過程[12]。當哺乳動物的皮膚黑色素細胞和成黑素細胞中有 c-kit 存在時，SCF介導黑色素細胞遷移、分化、生存、凋亡及黑色素生成等[21]。SCF有兩種亞型，即膜結合型和可溶型，在缺乏膜結合型 SCF 的小鼠中，成黑色素細胞可以被檢測到，但其不能遷移到皮膚組織，導致其毛色呈白色[22-23]。此外，表皮中 SCF 水平降低或者其對 c-kit 的競爭增強均會導致毛干不著色；相反，過表達膜結合型 SCF 會導致毛囊和表皮色素沉著過多[21]。

因此，我們推測，miR-27a 可能通過靶向SCF影響哺乳動物皮膚中的黑色素細胞及黑色素生成。

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