基于拉曼光譜的稻瘟病診斷

冷小梅， 譚 峰， 才巧玲， 薛齡季軒， 姜 珊， 李 冬

(黑龍江八一農墾大學信息技術學院，黑龍江 大慶 163319)

水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一，是中國糧食作物生產中不可或缺的一部分[1]。稻瘟病一直是水稻的重要病害之一，每年都有發生，嚴重時減產 40%～50%[2-6]。稻瘟病病菌的生命力極強，它可以在稻草和稻谷上過冬，在合適的環境下引起稻瘟病的發生[7]。

水稻稻瘟病檢測常采用近紅外光譜技術、多光譜成像技術、高光譜成像技術和圖像處理等方法。劉飛等[8]、譚峰等[9]應用可見近紅外光譜技術對水稻稻瘟病進行快速診斷。張浩等[10]利用多光譜成像技術對水稻穗頸瘟的嚴重程度識別進行了研究。楊燕[11]利用高光譜成像技術采集水稻稻瘟病植株圖像，再應用數據圖像處理方法對得到的稻瘟病圖像進行特征提取，建立病害識別模型。袁建清等[12]基于高光譜成像技術對寒地水稻葉瘟病病征與缺氮病征識別進行了研究。近年來，農作物病害檢測技術越來越多樣化[13-14]。但這些檢測技術實際操作難度較大，對環境要求嚴格，對樣品的要求也非常復雜[15]。

拉曼光譜技術是當前比較新穎、快捷的一種檢測方法，它既可以檢測有機物也可以檢測無機物，對于物質的氣態、固態、液態等狀態要求也不高[16-17]。對于具有相似分子結構的物質，利用拉曼光譜技術也可以檢測出他們之間的差異，有效地區分分子結構之間的不同[18]。因此，本研究采集正常水稻和帶有稻瘟病病菌的水稻植株拉曼光譜數據，對比分析有病害與無病害水稻植株細胞內部蛋白質、核酸、碳水化合物等的拉曼光譜差異，進而建立基于拉曼光譜的稻瘟病診斷方法。

1 材料與方法

2011-2014年從黑龍江省肇源縣二站鎮試驗田中采集吉粳88水稻植株樣品，用透明、密封、濕潤的塑料瓶盛裝以避免植株蒸騰失水。

選用DeltaNu公司生產的Advantage532型拉曼光譜儀，采用低功率5 mW配置。對無病害和有病害的水稻莖稈部位進行波段為200～3 400 cm-1的光譜采集，水稻莖部的拉曼特征峰敏感段也主要集中在 500～1 700 cm-1。對采集到的水稻莖部拉曼光譜進行預處理之后，利用Excel軟件對數據進行初步分析，計算出樣品的平均光譜，應用繪圖軟件Origin繪制圖形。

對采集到的原始數據進行處理，利用Matlab編寫的程序處理數據，得到樣品光譜的峰值；通過拉曼光譜儀自帶的光譜采集軟件NuSpec software，對光譜數據進行采集和存檔，數據連續自動地存為spc格式，光譜存為原始曲線；對數據庫進行定量分析，以Grams PLSIQ軟件制作的校正文件直接導入光譜儀軟件中，得到光譜數據的多種表征，對得到的數據進行比較和計算。

2 結果與分析

2.1 水稻植株正常莖稈與稻瘟病發病莖稈的拉曼光譜差異

用拉曼光譜儀采集寒地水稻無病害與有病害植株莖部的 200～3 400 cm-1波段光譜。結果顯示水稻植株莖部拉曼特征峰敏感段主要集中在 500～1 700 cm-1波段。對采集的數據利用Excel軟件進行分析，得到水稻植株正常莖稈與稻瘟病發病莖稈的拉曼光譜整體對比圖(圖1)。

圖1 水稻植株正常莖稈與稻瘟病發病莖稈的拉曼光譜整體對比圖Fig.1 Overall comparison chart of Raman spectra of normal stems and stems infected by rice blast of rice plants

拉曼特征峰的位移分為紅移和藍移，紅移表示從高頻率移到低頻率，藍移表示從低頻率移到高頻率。從圖1中可以看出正常莖稈波數562 cm-1的拉曼特征峰紅移到發病莖稈中的556 cm-1處，說明主鏈中酰胺VI的C=O變形能量降低，C=O雙鍵變長且相互作用的雙鍵能力變弱，同時也代表蛋白質肽鍵變弱。蛋白質側鏈中的苯丙氨酸殘基特征峰由1 615 cm-1藍移到1 619 cm-1處，使得苯丙氨酸殘基的振動能量增加，進一步表明發病莖稈中蛋白質的種類、空間結構發生明顯變化。DNA中堿基腺嘌呤特征峰由726 cm-1處藍移到730 cm-1，說明堿基中的腺嘌呤含量增加，同時說明DNA中堿基組織成分發生變化。碳水化合物中單糖拉曼特征峰由1 072 cm-1藍移到1 076 cm-1，說明葡萄糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸3種單糖中至少有1種單糖的化學鍵振動能量增加，連接的化學鍵相互作用增強；碳水化合物中的纖維素拉曼特征峰由1 446 cm-1紅移到1 440 cm-1處，說明多糖中纖維素化學鍵振動能量降低，進一步證明了稻瘟病發病莖稈中碳水化合物成分、結構出現異常。為了更加清晰地對比分析稻瘟病發病莖稈與正常莖稈拉曼特征峰數量的變化，將2株水稻植株拉曼光譜的相對強度進行細化(圖2)。

圖2 水稻植株正常莖稈與稻瘟病莖稈拉曼光譜對比圖Fig.2 The comparison chart of Raman spectra of normal stems and stems infected by rice blast of rice plants

對比圖2中稻瘟病發病莖稈與正常莖稈的拉曼光譜可以發現，在642 cm-1處發病莖稈的拉曼光譜沒有出現波峰，說明此處的酪氨酸特征峰消失了。而發病莖稈中DNA在1 328 cm-1處的胸腺嘧啶特征峰也消失了，說明胸腺嘧啶發生了強烈的化學變化，進一步說明稻瘟病病菌的侵染造成水稻組織內蛋白質、核酸、碳水化合物等分子結構發生變化。

從圖3中可以看出，水稻稻瘟病發病莖稈在527 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片中526 cm-1處的特征峰藍移得到的，說明蛋白質側鏈在此處的S-S鍵振動加強，相互作用增強。而稻瘟病發病莖稈在631 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片在636 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明蛋白質側鏈中的苯丙氨酸殘基的化學鍵振動能量減弱，即殘基間相互作用減弱，進一步說明當稻瘟病病菌侵入水稻莖部時，組織中蛋白質結構發生異常。

圖3 水稻植株稻瘟病發病葉片和莖稈拉曼光譜的整體對比圖Fig.3 Overall comparison chart of Raman spectra of leaves and stems of rice plants with rice blast

水稻稻瘟病發病莖稈拉曼光譜中在810 cm-1處存在RNA磷酸二酯PO2的特征峰，然而在發病葉片光譜中此處的特征峰消失，說明RNA結構發生變化。發病莖稈在1 099 cm-1處的特征峰是由發病葉片在1 095 cm-1處的特征峰藍移得到的，說明DNA中骨架磷酸之間的化學鍵振動能量增強，相互作用增強。也說明隨著稻瘟病病菌的侵染，水稻稻瘟病發病莖稈中RNA和DNA骨架磷酸發生變化。發病莖稈在1 215 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片在1 223 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明DNA中堿基腺嘌呤含量減少，化學鍵之間相互作用減弱。而發病莖稈在1 583 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片在1 586 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明在DNA堿基鳥嘌呤和腺嘌呤中至少有一種物質的化學結構發生變化。也進一步說明在受到稻瘟病病菌入侵的情況下，DNA中堿基結構發生了改變。發病莖稈中在1 111 cm-1處的拉曼特征峰消失，說明此處不存在D-甘露糖。發病莖稈在1 350 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片在 1 356 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明此處葡萄糖和葡萄糖醛酸中至少有一種物質的化學鍵發生斷裂。也說明稻瘟病病菌侵染對碳水化合物中單糖的影響。發病莖稈在1 366 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片在1 364 cm-1處的特征峰藍移得到的，說明此處多糖中的葡聚糖的化學鍵相互作用增強。發病莖稈在1 449 cm-1處的拉曼特征峰是由發病葉片在1 457 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明此處纖維素中化學鍵之間的相互作用減弱，也說明稻瘟病病菌侵染使碳水化合物分子結構發生變化。

由圖4可見，發病葉片在846 cm-1處的拉曼特征峰在發病莖稈光譜中消失，說明發病莖稈中酪氨酸的對羥苯基環化學鍵全部斷裂。發病葉片在1 678 cm-1處存在1個拉曼特征峰，而發病莖稈在此處存在2個非常小的拉曼特征峰，說明酰胺Ⅰ中β-折疊化學鍵振動能量變弱，β-折疊化學鍵之間的相互作用變弱。從圖4中還發現，在發病葉片光譜1 520 cm-1附近僅存在1個拉曼特征峰，而在發病莖稈光譜中存在3個小的拉曼特征峰，說明C=C雙鍵在此處的伸縮振動能量十分微弱，化學鍵斷裂十分嚴重且化學鍵之間的相互作用也十分脆弱。

圖4 水稻植株稻瘟病發病葉片和莖稈拉曼光譜的對比圖Fig.4 Comparison chart of Raman spectra of leaves and stems of rice plants with rice blast

2.2 水稻植株稻瘟病發病莖稈的拉曼頻率點變化

從500～1 700 cm-1波數范圍內挑選32個拉曼頻率點繪制散點圖(圖5)。從圖5中可以看出這32個拉曼頻率點的變化，整體來說發病莖稈的拉曼特征峰相對強度更加平穩，特別是871 cm-1、1 001 cm-1、1 153 cm-1、1 520 cm-14處的拉曼特征峰值發生了變化。在871 cm-1處蛋白質中的色氨酸的吲哚環含量降低，說明吲哚環遭到破壞；在1 001 cm-1處甲基(-CH3)的含量減少，說明-CH3的平面搖擺振動幾乎沒有發生；在1 153 cm-1處C-C單鍵含量減少，并且其右側半峰1 189 cm-1處的C-N 鍵幾乎全部斷裂；在1 520 cm-1處C=C雙鍵含量減少，且C=C 雙鍵的伸縮振動也在減弱。這幾處峰值的變化都充分說明在稻瘟病病菌的侵染下，水稻莖稈內蛋白質的多級結構和生理功能均出現異常。

圖5 水稻植株稻瘟病發病莖稈拉曼頻率點散點圖Fig.5 Raman scatter plot of infected stems of rice plants with rice blast

2.3 采用ROC曲線方法診斷水稻稻瘟病

用Spss統計軟件對稻瘟病發病莖稈和正常莖稈的拉曼光譜進行2個獨立樣本的t檢驗分析，結果顯示有顯著差異(P<0.05)。發現539 cm-1、793 cm-1、1 055 cm-1、1 364 cm-1特征峰強度(I539 cm-1、I793 cm-1、I1 055 cm-1、I1 364 cm-1)等在正常水稻莖部與稻瘟病發病組織中差異性不大，而I511 cm-1、I621 cm-1、I969 cm-1、I1 109 cm-1、I1 446 cm-1等在正常水稻莖部與稻瘟病發病組織中存在明顯差異。在此基礎上運用受試者工作特征曲線(ROC曲線)方法，對比正常水稻莖稈與稻瘟病發病莖稈拉曼譜線的靈敏度與特異性。如果曲線面積(AUC)>0.6，則說明具有顯著的診斷性，AUC越接近1.0，則說明診斷性越高。選擇7個具有代表意義的特征峰繪制ROC曲線(圖6)。

圖6中I1 154 cm-1曲線與I1 520 cm-1曲線由橫軸零點直接達到縱軸的最高點1.00的位置，曲線下的面積AUC=1.00，說明發病莖稈在1 154 cm-1和1 520 cm-1特征峰處C-C和C=C幾乎全部斷裂，或者說不存在C-C鍵和C=C雙鍵。I523 cm-1曲線在橫軸的0.33和0.67處有2個折點，曲線下面積AUC=0.86，說明發病莖稈在此處的S-S鍵變長，S-S鍵的扭曲-扭曲-反式構象變弱。I1 001 cm-1曲線在橫軸的0.67處出現折點，曲線面積AUC=0.97，說明發病莖稈在此處的甲基(-CH3)化學鍵斷裂十分明顯。I1 189 cm-1曲線在橫軸的0.33處出現折點，曲線面積AUC=0.94，說明發病莖稈在此處大部分的C-N鍵斷裂，且C-N鍵的伸縮振動十分微弱。I1 556 cm-1曲線在橫軸的0.17、0.33、0.83處出現折點，曲線面積AUC=0.97，說明發病莖稈在此處的色氨酸吲哚環之間相互作用的化學鍵減弱。I1 584 cm-1曲線在橫軸的0.33處出現折點，曲線面積AUC=0.83，說明發病莖稈在此處的DNA發生異常，鳥嘌呤和腺嘌呤中至少有1種物質發生改變。

圖6 正常水稻植株與稻瘟病發病莖稈的ROC曲線Fig.6 Receiver operating characteristic(ROC) curve of normal rice plants and infected stems of rice plants with rice blast

3 結 論

本研究嘗試將受試者工作特征曲線(ROC曲線)方法應用在水稻稻瘟病檢測。首先從蛋白質、核酸、碳水化合物方面對水稻莖部拉曼光譜在871 cm-1、1 001 cm-1、1 153 cm-1、1 520 cm-1處進行典型峰值的確認，根據C-C鍵、C=C鍵以及C-N鍵等化學鍵振動頻率的不斷減弱，以及DNA分子中腺嘌呤、鳥嘌呤等的結構異常，對水稻莖部進行稻瘟病診斷,選擇7個特征峰繪制ROC曲線，曲線下面積(AUC)最小為0.83，說明診斷性較明顯。其次利用Spss統計軟件對正常水稻莖稈及稻瘟病發病莖稈和葉片的拉曼光譜進行統計分析，通過對比兩者拉曼譜線在位移、峰數以及相對強度上的變化，判斷稻瘟病發病水稻植株內分子結構的改變，為稻瘟病早期檢測提供依據。

參考文獻：

[1] 彭昌家,白體坤,馮禮斌,等.南充市水稻稻瘟病綜合防控技術研究[J]. 中國農學通報,2015,31(11):190-199.

[2] 周 萌，鄧國富，梁海福，等. 抗稻瘟病優質秈型水稻不育系青A選育及應用[J]．南方農業學報，2017，48(1)：26-30.

[3] 周麗娜.基于葉綠素熒光光譜分析的稻葉瘟病害識別與預警[D].長春:吉林大學,2014.

[4] 朱 鳳,田子華,邰德良,等. 從 2014 年稻瘟病重發談今后防控對策的改進[J]. 江蘇農業科學,2016,44(8):155-158.

[5] 歐全宏,趙興祥,周湘萍,等.稻瘟病、玉米銹病和蠶豆銹病葉的傅里葉變換紅外光譜研究[J]. 光譜學與光譜分析,2012,32(9):2389-2392.

[6] 楊永義，張 華，宣 寧，等. 利用分子標記輔助選擇培育抗稻瘟病粳稻新品系[J]. 山東農業科學， 2016,48(11):18-20,25.

[7] 曾凡松,楊立軍,龔雙軍,等.稻瘟病生防菌JK-1的篩選、鑒定及其抑菌活性的研究[C]//中國植物保護學會.植保科技創新與農業精準扶貧——中國植物保護學會2016年學術年會論文集.北京:中國農業科學技術出版社,2016.

[8] 劉 飛,馮 雷,柴榮耀,等.基于直接正交信號校正的水稻冠層葉瘟光譜診斷[J]. 光學學報,2010,30(2):585-589.

[9] 譚 峰,汪 春,尚廷義.基于近紅外光譜的寒地水稻稻瘟病檢測數據分析[J]. 農機化研究,2011(11):44-47.

[10] 張 浩,姚旭國,毛雪琴,等.基于多光譜圖像的水稻穗頸瘟嚴重度識別研究[J]. 湖南農業科學,2009(1):65-68.

[11] 楊 燕.基于高光譜成像技術的水稻稻瘟病診斷關鍵技術研究[D].杭州:浙江大學,2012.

[12] 袁建清,蘇中濱,賈銀江,等.基于高光譜成像的寒地水稻葉瘟病與缺氮識別[J]. 農業工程學報,2016,32(13):155-160.

[13] 齊 龍,馬 旭,梁 柏,等.稻瘟病監測預測方法研究現狀及流行風險評估體系構建初探[J]. 中國農學通報,2011,27(33):213-216.

[14] 歐 琳,蘇 穎，陳 陽,等.基于拉曼光譜的鼻咽癌細胞株總蛋白放射敏感性研究[J]. 激光生物學報,2015,24(1):107-110.

[15] 易 品,邵超鵬,顧大勇,等.瘧色素應用于拉曼光譜技術檢測瘧疾研究進展[J]. 國際檢驗醫學雜志,2016,37(2):229-232.

[16] 翟 晨,彭彥昆，李永玉,等.基于拉曼光譜的蘋果中農藥殘留種類識別及濃度預測的研究[J]. 光譜學與光譜分析,2015,35(8):2180-2185.

[17] 譚 峰,才巧玲，孫雪成,等.基于拉曼光譜分析寒地水稻葉瘟病害植株特征[J]. 農業工程學報,2015,31(4):191-196.

[18] 李曉麗,羅榴彬，周斌雄,等.基于共聚焦顯微拉曼的真菌菌絲中幾丁質的原位檢測研究[J]. 光譜學與光譜分析,2016,36(1):119-124.