黃瓜綠斑駁花葉病毒 CP基因克隆及亞細(xì)胞定位

范小燕， 楊 柳， 季英華， 任春梅， 繆 倩， 韓玉春， 章松柏， 程兆榜， 魯紅學(xué)

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地，南京 210014； 3.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心，海口 570311)

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)是一種重要的植物病毒，主要危害西瓜、黃瓜、葫蘆、甜瓜、絲瓜、苦瓜等葫蘆科作物，自1935年英國(guó)科學(xué)家Anisworth[1]首次在黃瓜上報(bào)道該病毒以來，歐洲、亞洲、南美洲、北美洲以及中東的30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)CGMMV產(chǎn)生危害的報(bào)道[2]，對(duì)當(dāng)?shù)毓瞎愖魑锷a(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。CGMMV可以侵染多種葫蘆科作物，不同作物上的癥狀表現(xiàn)不盡相同，但都對(duì)作物產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[3-6]。在中國(guó)CGMMV于2005年在廣西觀賞南瓜上首次被發(fā)現(xiàn)[7]，目前已擴(kuò)散至遼寧、河北、湖北、湖南、廣東、山東、江蘇、甘肅等地[8-10]。鑒于該病毒的危害性，2006 年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第788 號(hào)公告正式將 CGMMV 列入農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名錄。

CGMMV是桿狀病毒科(Virgaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的重要成員，可通過帶毒種子、農(nóng)事操作、病殘?bào)w及授粉等多種方式傳播[11]，病毒粒子為大小約300 nm×18 nm的直桿狀顆粒，基因組全長(zhǎng)約6 400 bp，兩端各有一個(gè)非編碼區(qū)，中間包括4個(gè)開放閱讀框(Opening read fragment，ORF)[12]，分別編碼17 300外殼蛋白(Coat Protein，CP)、29 000移動(dòng)蛋白(Movement Protein，MP)、129 000和186 000復(fù)制蛋白[13-14]。

在黃瓜綠斑駁花葉病毒同屬(煙草花葉病毒屬)成員中，很多研究結(jié)果表明CP作為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒顆粒的組裝過程中起著十分重要的作用，同時(shí)CP還參與了病毒運(yùn)動(dòng)，病毒致病過程中癥狀的形成，合成負(fù)鏈RNA過程中煙草花葉病毒(TMV)復(fù)制酶的位點(diǎn)識(shí)別，病毒復(fù)制復(fù)合物(Virus replication complexes, VRCs)的調(diào)控等[15-19]多項(xiàng)功能的行使，這些結(jié)果表明CP在病毒的侵染循環(huán)中起著重要作用。

CP是病毒結(jié)構(gòu)蛋白[20]，Park等[21]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CP基因的西瓜對(duì)CGMMV有較好抗性，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)CGMMV CP蛋白第96位氨基酸對(duì)病毒的侵染起重要作用，這些結(jié)果暗示CGMMV的CP蛋白可能參與了病毒侵染過程中的多項(xiàng)生命活動(dòng)。因此，對(duì)CGMMV CP蛋白深入研究，將有助于了解其功能，揭示CGMMV致病機(jī)理，也為后續(xù)CGMMV的有效防控提供新的思路。

研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于研究其功能[23]。Yang等[24]在研究番茄金色花葉病毒(Tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)的AL2蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，AL2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布，與其激活病毒轉(zhuǎn)錄及抑制寄主的基因沉默功能對(duì)應(yīng)。潘江杰[25]在研究水稻白化致死基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)ABD基因定位于葉綠體中并參與了葉綠體發(fā)育、葉綠素合成降解及光合作用等調(diào)節(jié)，而突變體abd影響其葉綠體定位及功能，表現(xiàn)白化癥狀。姬金花[26]在研究佩梅病毒的PLP1基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)PLP1點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)無法在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊并轉(zhuǎn)運(yùn)，造成蛋白質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞的特殊反應(yīng)，最終引發(fā)佩梅病。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)正常行使功能離不開其在細(xì)胞內(nèi)的特定分布特征，因此針對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位展開研究也將有利于推動(dòng)蛋白質(zhì)功能的解析。

本研究選擇近年來在中國(guó)瓜類作物上肆虐危害的CGMMV江蘇分離物作為研究對(duì)象，通過設(shè)計(jì)特異性的引物，克隆其CP基因的全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建帶有YFP標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒CP-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后在本氏煙(Nicotianabenthamiana)葉片表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察研究CGMMV編碼的CP蛋白的亞細(xì)胞定位特征，為后續(xù)CGMMV CP的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試CGMMV毒源為2012年采自江蘇洪澤的西瓜分離物[27]，Taq酶、pMD18-T 載體及限制性內(nèi)切酶均購自 TaKaRa 公司，大腸桿菌Trans10感受態(tài)購自北京全式金生物公司，農(nóng)桿菌GV3101為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，35S∶YFP載體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授惠贈(zèng)，植物材料本氏煙為實(shí)驗(yàn)室保存，種植于實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱中。RNA提取試劑盒(Plant RNA Kit)購自O(shè)MEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit)與T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司，DNA 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，羊抗兔 IgG及綠色熒光蛋白抗體(THETMGFP Antibody)購自南京金斯瑞生物科技有限公司，ECL Western Blotting Substrate顯色試劑盒購自上海天能科技有限公司，引物合成及序列測(cè)定均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。序列比對(duì)等分析處理采用Clustal X、Bioedit、DNAstar等軟件完成。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g 病葉于液氮中速凍研磨，按試劑盒說明書提取總RNA。取500 ng RNA為模板，加入1 μl Oligo dT，1 μl 隨機(jī)引物和1 μl dNTP，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲取cDNA反應(yīng)產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CP基因克隆及其序列分析

根據(jù)CGMMV基因組序列設(shè)計(jì)CP全長(zhǎng)擴(kuò)增引物CGCP_BH1F：CGGGATCCATGGCTTACAATCCGATCAC (含BamHⅠ酶切位點(diǎn))和CGCPbr：CGGGATCCAGCTTTCGAGGTGGTAGC，以500 ng cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，按膠回收試劑盒說明書操作回收目的片段，連接到 pMD18-T 載體并通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans10 中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜至菌落長(zhǎng)出，菌落PCR和酶切鑒定陽性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無誤后獲得陽性克隆pMD18T-CP用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 CP-YFP載體構(gòu)建

按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作提取pMD18T-CP質(zhì)粒后進(jìn)行酶切，酶切體系：1 μlBamHⅠ，4 μl 10×T Buffer ，20 μl pMD18T-CP質(zhì)粒，ddH2O定容至40 μl。37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段通過T4連接酶連接到同樣經(jīng)BamH I酶切回收的線性化35S∶YFP載體，連接體系：目的片段回收產(chǎn)物7 μl ，1 μl T4 DNA 連接酶，1 μl 10×T4 DNA 連接酶緩沖液，1 μl 線性化35S∶YFP載體，16 ℃過夜連接。熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans10，菌落PCR擴(kuò)增和酶切鑒定陽性克隆，測(cè)序驗(yàn)證無誤后獲得陽性克隆CP-YFP用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 CP亞細(xì)胞定位觀察

利用電擊法將構(gòu)建好的CP-YFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以35S∶YFP空載體為對(duì)照，經(jīng)卡那霉素和利福平抗性平板篩選培養(yǎng)，最后通過菌落PCR 鑒定陽性克隆。

將轉(zhuǎn)入CP-YFP及35S∶YFP空載體的農(nóng)桿菌于含利福平及卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min，過夜培養(yǎng)至OD600為0.8～1.2；8 000 r/min 10 min收集菌體。用浸潤(rùn)液(10 mmol/L 氯化鎂，10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸，100 μmol/L 乙酰丁香酮)將重組農(nóng)桿菌菌體懸浮至OD600約0.5，28 ℃避光靜置2 h，使農(nóng)桿菌復(fù)蘇[28]。選取4～6葉齡健康本氏煙葉片進(jìn)行浸潤(rùn)，40 h后切取浸潤(rùn)區(qū)本氏煙葉片于激光共聚焦顯微鏡(ZEIZZ LSM710)488 nm激發(fā)光下觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況及其亞細(xì)胞定位特征。

細(xì)胞核染色采用DAPI法：在制好的玻片上滴加適量DAPI染液(100 ng/ml)，避光染色10 min，流水沖去染液，于激光共聚焦顯微鏡 360～400 nm激發(fā)光下觀察。

1.6 總蛋白質(zhì)抽提與免疫印跡試驗(yàn)

浸潤(rùn)處理40 h后，稱取 0.4 g浸潤(rùn)區(qū)葉片，加入1 ml 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰上研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中，漩渦震蕩混勻，12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入適量聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)5×上樣緩沖液，沸水煮10 min，-20 ℃保存。

取適量蛋白質(zhì)樣品于12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，在電轉(zhuǎn)移緩沖液中通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上(260 mA 恒流電泳1 h)，取出PVDF膜，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)漂洗3次，每次5 min，將膜浸入封閉液中(5%脫脂奶粉)，120 r/min搖動(dòng)封閉1 h，PBST漂洗3次，每次5 min，將GFP抗體以1∶5 000稀釋于PBST中，浸沒PVDF膜，4 ℃保溫過夜，PBST漂洗3次，每次5 min，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以1∶2 000稀釋于PBST中，浸沒PVDF膜，室溫結(jié)合1 h，PBST漂洗3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMMV CP基因克隆

以病樣總RNA為模板，利用CGMMV外殼蛋白特異性引物CGCP_BH1F和CGCPbr 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)有一條大小約500 bp的特異性條帶(圖1a)，與預(yù)期的目標(biāo)大小(486 bp)基本一致，說明該條帶就是本研究要擴(kuò)增的目的基因條帶。利用DNA凝膠回收試劑盒回收該目的片段，將目的片段連接克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化Trans 10感受態(tài)細(xì)胞。利用菌落PCR及酶切驗(yàn)證(圖1b)篩選陽性克隆，獲得的陽性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證無誤后，從而獲得重組陽性質(zhì)粒pMD18T-CP。

2.2 序列特征分析

分析獲得的CGMMV江蘇分離物的CP基因堿基序列，發(fā)現(xiàn)其全長(zhǎng)486 bp，編碼一個(gè)161個(gè)氨基酸大小約17 500的蛋白質(zhì)，與之前報(bào)道的江蘇分離物(KC852073)CP基因堿基序列完全一致(圖2)。

本研究對(duì)已報(bào)道的CGMMV其他分離物編碼的CP蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的CGMMV江蘇分離物編碼的CP蛋白氨基酸序列除與之前報(bào)道的江蘇分離物序列完全一致外，與中國(guó)山東分離物、遼寧分離物、廣西分離物、河北分離物、臺(tái)灣分離物的蛋白質(zhì)氨基酸序列都完全一致，不僅如此，它與印度分離物、韓國(guó)分離物、日本分離物及一個(gè)俄羅斯分離物(GQ495274)的序列也完全一致(圖2)。表明CGMMV編碼的CP蛋白是一個(gè)相對(duì)比較保守的蛋白質(zhì)，選用CGMMV江蘇分離物進(jìn)行研究具有很好的代表性。

a：CGMMV CP基因RT-PCR擴(kuò)增；b：PMD18T-CP酶切驗(yàn)證(Bam H I)。圖1 CGMMV編碼的CP基因RT-PCR擴(kuò)增及克隆Fig.1 PCR amplification and cloning of CGMMV CP gene

圖2 CGMMV CP蛋白氨基酸序列分析結(jié)果Fig.2 The sequence analysis of CGMMV CP protein

2.3 CP-YFP載體構(gòu)建

利用基因克隆時(shí)引入的BamH I酶切位點(diǎn)，通過BamH I酶切pMD18T-CP獲得了兩條片段，其中一條大小在2 000 bp和3 000 bp之間(pMD18-T)，另一條大小約500 bp，與486 bp 的CP大小基本一致(圖1b)，利用DNA凝膠回收試劑盒回收大小約500 bp的CP片段，通過T4連接酶將該目的片段連接到BamHⅠ處理后純化回收的YFP空載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Trans 10感受態(tài)細(xì)胞。鑒于CP基因是經(jīng)單酶切(BamH I)插入35S∶YFP載體，因此CP可以正向插入，亦可反向插入，為了保證插入方向正確，本研究在篩選陽性克隆時(shí)引入了一條位于35S啟動(dòng)子區(qū)域的引物(35SF)，該引物與CP基因擴(kuò)增引物的R端引物配對(duì)進(jìn)行菌落PCR篩選(圖3)，篩選到的陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定(BamH I)，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，有大小兩條帶：一條大小在15 000 bp 左右(35S∶YFP載體)，另一條大小約500 bp，與CP目的片段大小一致。表明融合YFP標(biāo)簽的CP重組表達(dá)載體CP-YFP構(gòu)建成功。

a：CP-YFP載體構(gòu)建示意圖；b：CP-YFP酶切驗(yàn)證；c：CP-YFP PCR驗(yàn)證圖。圖3 CP-YFP載體構(gòu)建Fig.3 Construction of CP-YFP vector

2.4 CP蛋白亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建好的CP-YFP質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)浸潤(rùn)液處理后接種本氏煙(Nicotianabenthamiana)葉片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)接種40 h后，浸潤(rùn)C(jī)P-YFP的本氏煙葉片細(xì)胞中有明顯的熒光信號(hào)，熒光除了在細(xì)胞質(zhì)有分布外，在細(xì)胞核也疑似有分布，為了進(jìn)一步印證其在細(xì)胞核的分布，本研究采用DAPI處理細(xì)胞核后進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞核存在重合(圖4)。表明CP在本氏煙表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有分布。

a：對(duì)照組YFP亞細(xì)胞定位；b：帶YFP標(biāo)簽的CP蛋白亞細(xì)胞定位(小圖示意CP在細(xì)胞核內(nèi)分布)。圖4 CP蛋白亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of CP protein

2.5 CP-YFP的表達(dá)檢測(cè)

為了進(jìn)一步印證CP-YFP在本氏煙葉片細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)排除空載體等因素的干擾，本研究以GFP抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗檢測(cè)本氏煙中YFP和CP-YFP的表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示，接種CP-YFP的本氏煙樣品在接近48 000處有特異性條帶出現(xiàn)，與預(yù)期的CP-YFP融合蛋白大小44 000基本吻合；而接種YFP的本氏煙樣品在 25 000～35 000有明顯條帶，與YFP大小27 000相吻合(圖5)。表明浸潤(rùn)接種的CP-YFP在本氏煙葉片細(xì)胞中成功表達(dá)，同時(shí)也印證了激光共聚焦顯微鏡下觀察到的本氏煙葉片細(xì)胞中的熒光信號(hào)是由CP-YFP在煙草葉片中順利表達(dá)產(chǎn)生的。

圖5 免疫印跡法檢測(cè)YFP及CP-YFPFig.5 Detection of YFP and CP-YFP by Western blot

3 討 論

CGMMV是一種主要侵染葫蘆科作物的重要病毒，由于其對(duì)西瓜、黃瓜等作物造成的嚴(yán)重?fù)p失，已被世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)列為檢疫性有害生物，成為困擾產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。本研究選擇2012年采自江蘇洪澤的CGMMV西瓜分離物作為研究對(duì)象，對(duì)其CP基因進(jìn)行了克隆和序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP基因全長(zhǎng)486，編碼一個(gè)17 500的蛋白質(zhì)，與中國(guó)山東、遼寧、廣西、河北、臺(tái)灣等其他分離物序列完全一致(序列相對(duì)保守)，為進(jìn)一步研究其亞細(xì)胞定位特征，本研究構(gòu)建了帶有YFP熒光標(biāo)簽的重組表達(dá)載體CP-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后浸潤(rùn)接種本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有分布，為后續(xù)進(jìn)一步研究CGMMV CP功能奠定了基礎(chǔ)。

在煙草花葉病毒屬典型成員TMV的研究中也有報(bào)道顯示CP在細(xì)胞質(zhì)有分布，如早年Martin[29]在研究TMV時(shí)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)存在大量病毒粒子，而CP是TMV的結(jié)構(gòu)蛋白，暗示了CP在細(xì)胞質(zhì)有分布。Hills[30]在利用免疫膠體金技術(shù)研究TMV編碼蛋白質(zhì)定位時(shí)證實(shí)CP在細(xì)胞質(zhì)有分布。Bendahmane等[31]在利用BY-2原生質(zhì)體研究TMV時(shí)，也發(fā)現(xiàn)CP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有分布。彭浩然等[32]在利用激光共聚焦顯微鏡研究番茄花葉病毒(ToMV)編碼的CP蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)CP在細(xì)胞質(zhì)有分布，由于煙草花葉病毒屬內(nèi)很多病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組裝等一系列重要的生命活動(dòng)大都是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成的[33-35]，因此CP的細(xì)胞質(zhì)定位特征與這些功能研究結(jié)果相吻合。在本研究確定CGMMV編碼的CP在細(xì)胞質(zhì)中有分布，暗示了CGMMV編碼的CP在細(xì)胞質(zhì)中可能參與了這些功能的行使。

本研究結(jié)果表明，CGMMV編碼的CP除了在細(xì)胞質(zhì)有分布外在細(xì)胞核也有分布，而在同屬TMV的研究中，Honda等[36]在利用電鏡觀察病樣切片時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中存在病毒粒子形成的聚合體。Hirai等[37]在研究TMV侵染特征時(shí)發(fā)現(xiàn)在TMV侵染早期(6～18 h)，病毒外殼蛋白會(huì)在細(xì)胞核中積累。Reddi[38]在研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。杜利娟[39]在利用激光共聚焦顯微鏡研究TMV及TuMV編碼的CP蛋白亞細(xì)胞定位時(shí)發(fā)現(xiàn)二者在寄主細(xì)胞核也有分布。這些結(jié)果表明病毒的CP在細(xì)胞核也有分布，但是CP在細(xì)胞核內(nèi)的功能目前還未見相關(guān)報(bào)道，因此針對(duì)其核定位特征研究其相關(guān)功能，可能有助于更深入解析病毒的致病機(jī)理，為病毒的有效防控提供新的思路。

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