黨參多糖對仔豬小腸黏膜免疫功能的影響

李 成, 尹莉莉, 朱電鋒, 何嫣婷, 李曼曼, 丁雪東, 李 玉, 王希春, 吳金節

(安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036)

黨參(Codonopsispillosula)是中國傳統的補益藥材之一，常被作為人參的替代品。植物黨參的藥用部位是它的干燥根，可用于脾肺氣虛、內熱消渴、氣短心悸、食少便溏等的治療[1]。黨參的主要成分有糖類、生物堿類、甾類、多炔類、苯丙苷類、三萜類、倍半萜類、氨基酸類、揮發油及微量元素[2]。大量研究證明多糖在黨參中所占比例最大，為黨參重要的活性成分，具有免疫調節、消除自由基、造血、抗疲勞及提高動物生產性能等作用[3-4]。黨參能夠扶正固本，增強機體免疫能力。劉合軍等[5]研究發現，添加有黨參的中藥復方制劑可增加早期斷奶仔豬腸道微生態的多樣性，有效提高腸道健康水平。張曉君等[6]研究發現，黨參多糖對體液免疫和細胞免疫有一定的促進作用。徐小波等[7]發現飼料中添加黨參等中草藥可以有效提高育肥性能，改善豬肉品質。石鐵男等[8]研究發現黨參多糖可以提高肉仔雞免疫球蛋白G(IgG)含量和腸道分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量，增強肉仔雞的腸黏膜免疫功能。賈宇等[9]用環磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，并飼喂復方黨參提取物，一段時間后小鼠的一些免疫指標明顯升高，說明復方黨參提取物對其有免疫保護作用。

目前關于黨參多糖(CPP)的研究主要集中在黨參多糖的提取方法和有效成分提純以及對動物的生長性能、免疫功能的影響方面。而從分子層面上研究黨參多糖對仔豬小腸黏膜免疫的影響未見系統報道。本試驗在仔豬日糧中添加不同劑量的黨參多糖，通過分析仔豬小腸免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的表達與mRNA相對表達量的變化，進一步探討黨參多糖對仔豬小腸黏膜免疫功能的影響，為今后黨參多糖的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

杜×長×大三元雜交仔豬由安徽省青陽縣五星畜牧種豬場提供。黨參中藥材購自安徽亳州濟仁堂藥業有限公司。TransScript? First-StrandcDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Top Green qPCRSuperMix購自北京TransGen生物公司。三氯甲烷、水飽和酚、異戊醇、無水乙醇、乙酸鈉、乙酸鉀，無錫展望化工公司產品。離心管、TIP頭，美國Axygen Biosciences公司產品；BSD-100電熱恒溫培養箱，上海博訊醫療設備廠產品；微量移液器，德國Eppendorf公司產品；MK3型半自動酶聯免疫分析儀、NanoVue plus、PCR儀，美國Thermo公司產品；TGL-18R臺式高速離心機，珠海黑馬醫學儀器有限公司產品；超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司產品。

1.2 黨參多糖的制備

稱取6 kg黨參，去除雜質，清洗3次，瀝干水分。按照料液比1∶10的比例加入60 L 濃度為84%的酒精，提取3次，每次1 h，去除油脂，烘干，稱質量。按照料液比1∶20加入純水，超聲波振蕩提取40 min，將提取液轉移到濃縮罐中進行濃縮，經濃縮、真空冷凍干燥制成粉末。制備完成后采用硫酸苯酚法測得每1 g黨參制得0.11 g黨參多糖粉末。

1.3 試驗動物分組與飼養管理

選取健康的6窩60頭1日齡“杜×長×大”三元雜交仔豬，隨機分為3組，即對照組、CPP低劑量組、CPP高劑量組。所有仔豬于7日齡開始誘導哺乳仔豬食用代乳料(配方及營養水平見表1)，14日齡開始在3組仔豬中分別飼喂代乳料(對照組)、代乳料+1%(以生藥計)CPP(低劑量組)、代乳料+2% CPP(高劑量組)。21日齡斷奶，試驗期為14 d，常規飲水。消毒及免疫程序嚴格按照豬場管理方案進行。

表1仔豬代乳料配方及其營養水平

Table1Ingredientsandnutrientlevelsofthemilkreplacerforpiglet

日糧組成含量 營養指標含量全脂奶粉(%)46．00消化能(MJ/kg)14．50脫脂奶粉(%)42．20干物質(%)75．00乳清粉(%)10．50粗蛋白(%)27．90食鹽(%)0．30賴氨酸(%)1．61預混料(%)1．00Ca(%)1．04總計100．00P(%)0．89

預混料為每1 kg代乳料提供：VA7 000 IU，VD32 000 IU，VE10 IU，VK32.200 0 mg，VB12.375 0 mg，VB24.800 0 mg，VB60.150 0 mg，VB120.017 5 mg，煙酸(煙酸胺)16.000 0 mg，泛酸鈣5.750 0 mg，葉酸0.850 0 mg，生物素0.017 5 mg，賴氨酸0.950 0 mg，抗氧化劑0.045 0 mg，酶制劑1 100.000 0 mg，香味劑45.000 0 mg，甜味劑45.000 0 mg，Mn(MnSO4·H2O)20.180 0 mg，I(KI) 0.400 0 mg，Se(Na2SeO3) 0.350 0 mg。

1.4 樣品采集與保存

仔豬28日齡時，各組隨機選取6頭仔豬剖殺，取十二指腸、空腸3段(前端、中段、末端)、回腸，清除腸內容物。一部分剪碎后液氮保存，用于測定IgA、IgM、IgG的mRNA相對表達量，余下組織保存于4%多聚甲醛中，用于測定SIgA蛋白表達量。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 仔豬小腸各段SIgA、IgM、IgG表達量的測定 制作組織切片，免疫組化法(IHC)檢測仔豬小腸各段組織SIgA、IgM及IgG蛋白表達水平，同時設置陰性對照，以PBS替代一抗、二抗。試驗結束后采用Olympus顯微鏡Images圖像分析系統對免疫組腸道組織進行拍照，同一組織選擇3個視野，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對圖片進行分析統計，結果以平均光密度值(Density mean)表示。

1.5.2 仔豬小腸各段IgA、IgM、IgGmRNA相對表達量 依據GenBank中的豬IgA、IgM、IgG及內參18S的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表2)，引物由北京全式金生物公司合成。采用TransScript? First-StrandcDNA Synthesis SuperMix試劑盒，通過RT-PCR法檢測IgA、IgM、IgGmRNA相對表達。

1.6 數據處理

表2用于PCR擴增的引物序列

Table2PrimersforPCRamplification

引物 引物序列(5′→3′)擴增片段長度(bp)IgA?FTCCAGCCAGTCCGTGAAC122IgA?RATTGGAGCCCAGGAGCAGIgG?FAAGGAGGAGCAGTTCAACAG86IgG?RTTGAACTCCTTCCCGTTCAGIgM?FACAGGAGGGAAGTTGAGACG131IgM?RGTTTGGGTCTCTAACTGCTC18S?FCGGCGACGACCCATTCGAAC9818S?RGAATCGAACCCTGATTCCCCGTC

2 結果與分析

2.1 黨參多糖對仔豬小腸黏膜SIgA蛋白表達的影響

小腸黏膜SIgA表達情況如圖1所示，SIgA表達陽性區域呈現棕黃色，主要分布在腸黏膜上皮腸腔表面以及腸黏膜固有層小腸腺內部，組織經蘇木素復染，細胞核呈深藍色，細胞質為淺藍色，細胞膜不著色。

表3顯示，CPP高劑量組仔豬十二指腸SIgA蛋白表達水平極顯著高于對照組(P<0.01)且顯著高于低劑量CPP組(P<0.05)，低劑量CPP組仔豬十二指腸SIgA蛋白表達水平高于對照組，差異不顯著(P>0.05)；仔豬空腸前段SIgA蛋白表達水平CPP組極顯著高于對照組(P<0.01)，兩CPP組SIgA蛋白表達水平差異不顯著(P>0.05)；CPP高劑量組仔豬空腸中段SIgA蛋白表達水平極顯著高于對照(P<0.01)，CPP低劑量組顯著高于對照(P<0.05)，且高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)；高劑量CPP組仔豬空腸末段SIgA蛋白表達水平極顯著高于對照(P<0.01)，低劑量CPP組與對照差異不顯著(P>0.05)，且兩CPP組之間無顯著差異(P>0.05)；仔豬回腸SIgA蛋白表達量CPP組極顯著高于對照(P<0.01)，且CPP高劑量組極顯著高于CPP低劑量組(P<0.01)。

2.2 黨參多糖對仔豬小腸IgG蛋白表達的影響

由圖2可見，IgG蛋白表達陽性區域呈現棕黃色，主要分布在腸黏膜固有層，并有陽性細胞分散或集中分布其中，顏色較深，面積較小。組織經蘇木素復染，細胞核呈深藍色，細胞質為淺藍色，細胞膜不著色。

仔豬十二指腸IgG蛋白表達水平CPP高劑量組顯著高于CPP低劑量組和對照組(P<0.01)，CPP低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)；空腸前段和末段以及回腸IgG蛋白表達水平變化趨勢同十二指腸；空腸中段IgG蛋白表達水平，CPP高劑量組顯著高于CPP低劑量組(P<0.05)，極顯著高于對照組(P<0.01)，CPP低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)(表4)。

2.3 黨參多糖對仔豬小腸IgM蛋白表達的影響

圖3顯示，IgM表達陽性區域呈現棕黃色，主要分布在腸黏膜上皮腸腔表面、小腸腺內部，少量分布在固有層。組織經蘇木素復染，細胞核呈深藍色，細胞質為淺藍色，細胞膜不著色。

表5表明，仔豬十二指腸IgM蛋白表達水平CPP高劑量組極顯著高于CPP低劑量組和對照組(P<0.01)，CPP低劑量組高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。CPP高劑量組仔豬空腸前段IgM蛋白表達水平極顯著高于對照組(P<0.01)，顯著高于CPP低劑量組(P<0.05)，與對照組比較，CPP低劑量組顯著升高(P<0.05)。空腸中段、回腸IgM蛋白表達與空腸前段變化趨勢基本一致；空腸末段IgM蛋白表達水平CPP高劑量組極顯著高于對照組(P<0.01)，CPP低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，兩CPP組之間差異不顯著(P>0.05)。

A:對照組;B:黨參多糖低劑量組;C:黨參多糖高劑量組;D:陰性對照;1:十二指腸;2:空腸前段;3:空腸中段;4:空腸末段;5:回腸。圖1 黨參多糖對仔豬小腸SIgA陽性產物表達的影響(×400)Fig.1 Effect of supplementary Codonopsis pilosula polysaccharide (CPP) on intestinal SIgA positive product in piglets(×400)

表3黨參多糖對仔豬小腸SIgA蛋白表達水平的影響

Table3EffectofCPPonSIgAexpressioninintestinaltissuesofpiglets

處理 SIgA蛋白表達水平(以平均光密度值表示)十二指腸空腸前段空腸中段空腸末段回腸對照組0．20±0．02Bb0．19±0．01Bb0．20±0．01Bc0．20±0．02Bb0．20±0C低劑量組0．22±0．01ABb0．22±0．01Aa0．23±0．01ABb0．22±0ABab0．22±0．01B高劑量組0．25±0．01Aa0．24±0．01Aa0．25±0．01Aa0．24±0．01Aa0．24±0．01A

同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

A:對照組;B:黨參多糖低劑量組;C:黨參多糖高劑量組;D:陰性對照;1:十二指腸;2:空腸前段;3:空腸中段;4:空腸末段;5:回腸。圖2 黨參多糖對仔豬小腸IgG陽性產物表達的影響(×400)Fig.2 Effect of supplementary CPP on intestinal IgG positive product in piglets(×400)

表4CPP對仔豬小腸IgG蛋白表達水平的影響

Table4EffectofCPPonIgGexpressioninintestinaltissuesofpiglets

處理 IgG蛋白表達水平(以平均光密度值表示)十二指腸空腸前段空腸中段空腸末段回腸對照組0．22±0Bb0．21±0．01Bb0．21±0．01Bb0．20±0．01Bb0．21±0．01Bb低劑量組0．23±0．01Bb0．22±0Bb0．23±0．01ABb0．22±0．01Bb0．23±0．01Bb高劑量組0．27±0．01Aa0．26±0．01Aa0．25±0．02Aa0．25±0．11Aa0．26±0．02Aa

同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表5CPP對仔豬小腸組織IgM蛋白表達的影響

Table5EffectofCPPonIgMexpressioninintestinaltissuesofpiglets

處理 IgM蛋白表達水平(以平均光密度值表示)十二指腸空腸前段空腸中段空腸末段回腸對照組0．20±0．01Bb0．19±0．01Bc0．20±0．01Bc0．19±0Bb0．20±0Bc低劑量組0．21±0Bb0．21±0ABb0．22±0．01ABb0．22±0．01ABa0．22±0．01ABb高劑量組0．27±0．01Aa0．24±0．02Aa0．24±0．01Aa0．23±0．02Aa0．23±0．01Aa

同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.4 黨參多糖對仔豬小腸黏膜IgA mRNA相對表達量的影響

CPP高劑量組十二指腸IgAmRNA相對表達量極顯著高于CPP低劑量組和對照組(P<0.01)，CPP低劑量組極顯著高于對照組 (P<0.01)，空腸前段、空腸中段、空腸末段、回腸IgAmRNA相對表達量變化趨勢與十二指腸一致(表6)。

表6CPP對仔豬小腸組織IgAmRNA相對表達量的影響

Table6EffectofCPPonIgAmRNArelativeexpressioninintestinaltissuesofpiglets

對照 IgAmRNA相對表達量十二指腸空腸前段空腸中段空腸末段回腸對照組1．00±0．15C1．00±0．14C1．00±0．14C1．00±0．01C1．00±0．02C低劑量組1．61±0．03B1．65±0．12B1．70±0．03B1．63±0．12B1．98±0．06B高劑量組2．86±0．19A2．9±0．27A2．91±0．18A2．63±0．15A2．75±0．18A

同一列中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 黨參多糖對仔豬小腸黏膜IgG mRNA相對表達量的影響

仔豬十二指腸IgGmRNA相對表達量CPP高劑量組極顯著高于對照組(P<0.01)，CPP低劑量組顯著高于對照(P<0.05)，且CPP高劑量組顯著高于CPP低劑量組 (P<0.05)(表7)。CPP組仔豬空腸前段IgGmRNA相對表達量極顯著高于對照組 (P<0.01)，且CPP高劑量組極顯著高于CPP低劑量組(P<0.01)。空腸中段IgGmRNA相對表達量變化趨勢與空腸前段一致。仔豬空腸末段IgGmRNA相對表達量CPP高劑量組高于CPP低劑量組和對照組，差異極顯著(P<0.01)，與對照組相比CPP低劑量組顯著升高(P<0.05)。仔豬回腸IgGmRNA相對表達量CPP組極顯著高于對照(P<0.01)，CPP高劑量組顯著高于CPP低劑量組 (P<0.05)。

表7CPP對仔豬小腸組織IgGmRNA相對表達量的影響

Table7EffectofCPPonIgGmRNArelativeexpressioninintestinaltissuesofpiglets

對照 IgGmRNA相對表達量十二指腸空腸前段空腸中段空腸末段回腸對照組1．00±0．07Bc1．00±0．03C1．00±0．02C1．00±0．08Bc1．00±0．01Bc低劑量組1．19±0．04ABb1．13±0．02B1．28±0．01B1．15±0．03Bb1．29±0．07Ab高劑量組1．41±0．10Aa1．31±0．02A1．56±0．02A1．32±0．03Aa1．50±0．15Aa

同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.6 黨參多糖對仔豬小腸黏膜IgM mRNA相對表達量的影響

表8顯示，仔豬十二指腸IgMmRNA相對表達量CPP組極顯著高于對照組(P<0.01)，CPP高劑量組極顯著高于CPP低劑量組 (P<0.01)。空腸前段、空腸末段、回腸IgMmRNA相對表達量變化趨勢同十二指腸。CPP高劑量組仔豬空腸中段IgMmRNA相對表達量極顯著高于CPP低劑量組和對照組 (P<0.01)，CPP低劑量組IgMmRNA相對表達量顯著高于對照(P<0.05)。

表8CPP對仔豬小腸組織IgMmRNA相對表達量的影響

Table8EffectofCPPonIgMmRNArelativeexpressioninintestinaltissuesofpiglets

對照 IgMmRNA相對表達量十二指腸空腸前段空腸中段空腸末段回腸對照組1．00±0．13C1．04±0．17C1．02±0．22Bc1．00±0．05C1．00±0．03C低劑量組1．36±0．10B1．41±0．06B1．39±0．05Bb1．44±0．15B1．51±0．05B高劑量組1．85±0．06A2．11±0．10A2．26±0．06Aa2．33±0．10A2．45±0．10A

同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

初生仔豬生長發育迅速，自身免疫系統和消化系統還未完全發育。早期斷奶會使仔豬機體產生較大的應激反應，造成食欲不振、消化不良、腹瀉等現象[10]。有研究結果表明，哺乳動物的胃腸道黏膜是一種特殊的黏膜免疫器官[11]。斷奶應激破壞仔豬腸道黏膜屏障進而造成仔豬腸道免疫功能受損[11-12]。仔豬必須吸收大量養分來增強自身免疫力，在斷奶后2周最為明顯。因此，仔豬安全度過斷奶初期最重要的條件就是其血清中要維持較高的免疫球蛋白水平。

體液免疫是構成機體免疫功能的重要組成部分之一，而免疫球蛋白在體液免疫過程中發揮著重要作用[13]。免疫球蛋白廣泛存在于血液、體液內，也存在于外分泌液中，具有結合抗原等生物學效應。其中IgG是血清中的主要抗體，在動物體內發揮抗菌、抗病毒、抗毒素等作用；IgA分為血清型和分泌型，具有維持黏膜上皮結構和功能完整性的作用；IgM是體液免疫中最先出現的免疫球蛋白，在抗感染中起著先鋒作用[14]。IgG由脾臟、淋巴結及黏膜等處漿細胞分泌，是機體自然感染和人工主動免疫后所產生的介導體液免疫的主要抗體，在血清中含量最高，持續時間長，主要功能為阻止病菌、毒素及病毒等抗原穿透黏膜進入組織內。

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是由腸道固有層漿細胞產生并分泌至腸腔發揮免疫調節作用的一類蛋白質，具有調控腸道微生物菌群和中和毒素的作用，是腸黏膜重要的效應分子[15]。分泌型免疫球蛋白A與其他免疫因子共同作用還可以阻止病原微生物黏附到腸黏膜并有效抑制黏膜相關炎癥反應的發生，維護腸道不受損傷[16]。IgM不是抗感染免疫的主力，但當機體缺乏IgA時，IgM發揮主要作用。在腸黏膜免疫中，以SIgA為主的體液免疫占主導地位，主要作用包括組織病原體粘附、中和病毒、中和毒素及免疫排除[17]。黏膜上皮及固有層內含有大量免疫細胞及免疫分子，通過SIgA和IgM發揮作用,阻止病原微生物在黏膜上皮層定殖[18]。因此以SIgA為主的體液免疫在腸道免疫中起主導作用，是黏膜防御病原體在腸道中的粘附和定殖的第一道防線[19-22]，可以有效保護腸道黏膜免受病原體的入侵和抑制病毒的復制[23]。楊光等[24]在研究黨參多糖對小鼠免疫功能的影響時，分別用羊紅細胞和卵清蛋白作為抗原注射小鼠并給小鼠灌服黨參多糖，發現小鼠抗體水平提高，證實黨參多糖對小鼠特異性抗體生成有促進作用。張曉君等[6]研究黨參多糖對造血功能的影響時發現，免疫功能低下小鼠在黨參多糖的作用下機體內血清溶血素抗體IgM水平提高，一定劑量的黨參多糖對環磷酰胺致免疫功能低下小鼠的遲發型超敏反應也有顯著提高，還能抑制環磷酰胺導致的胸腺和脾臟萎縮，說明黨參多糖對體液免疫和細胞免疫有一定的促進作用。劉文生等[25]對黨參多糖、皂甙的藥理作用進行了研究，結果顯示黨參多糖、皂甙不同程度地提高了小鼠脾臟及胸腺指數，增強了腹腔巨噬細胞的吞噬活性和血清中IgG含量，提示黨參多糖及皂甙對小鼠免疫功能具有改善作用。本試驗結果顯示，黨參多糖能提高仔豬小腸組織中SIgA、IgG、IgM蛋白的表達水平以及IgA、IgG、IgMmRNA的相對表達量，增強仔豬的腸道黏膜免疫功能，且代乳料中添加2%黨參多糖的作用效果優于添加1%黨參多糖的效果。

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