植物基因啟動子的克隆及分析的研究進展

馬 倩，馬寶月，穆 波，馬 慧

（沈陽農業大學生物科學技術學院，沈陽 110161）

啟動子在基因轉錄調控中占有核心地位，決定基因的表達水平，是位于基因的上游、能夠活化RNA聚合酶的一段DNA序列。在高等植物中，基因的表達調控過程主要有DNA水平、染色體水平、轉錄調控、轉錄后調控、翻譯調控和翻譯后調控，在這六大調控方式中，轉錄水平的調控方式是最為主要的，它主要受順勢作用原件與轉錄因子之間的協調作用。而在啟動子區域，有很多能夠在轉錄水平調控過程中具有重要作用順勢作用原件，其通過驅動下游基因的表達來增加植物對非生物脅迫的抵抗能力。所以，對啟動子進行克隆，并仔細分析其序列功能對具有重要作用的功能原件和調控區域進行精準的定位。有利于研究基因的調控機制及轉錄調控模式，并且應用于基因工程從而進行植物遺傳改良。

1 克隆啟動子的幾種常用方法

1.1 常規的PCR技術克隆啟動子

利用常規PCR方法，根據已知的啟動子序列來設計擴增全長序列的引物，由于該方法操作簡便并且快捷，所以，近年來被廣泛的應用在克隆序列已知的基因啟動子中，但是此方法不能用來克隆未知的啟動子序列。

自從1985年PCR技術誕生以來，通過PCR技術來克隆基因啟動子便成為了最常見的一種方法。Tao等（2014）根據已發表的玉米ZmRXO1基因的啟動子序列設計引物，以玉米的基因組DNA為模板，利用PCR技術擴增反應得到1576 bp的ZmRXO1基因的啟動子。蘇寧等（2003）以已經發表的水稻中葉綠體的16S rRNA基因的啟動子堿基序列為理論依據進行引物的設計，以水稻的葉綠體DNA為模板，利用PCR技術進行擴增反應，發現擴增出的序列與已知的啟動子序列同源性高達100%。由此可見，利用常規PCR方法克隆已知序列的啟動子，操作簡單、便捷，準確度高。但缺點在于不能克隆新的啟動子。

1.2 反向PCR

反向PCR（I-PCR，Inverse PCR）是Triglia等（1998）最早提出的在PCR基礎上改進的染色體步移的技術。其原理如圖1所示：首先使用合適的限制性內切酶將植物的基因組DNA進行酶切反應，然后利用T4連接酶將DNA片段自連，使其形成環狀的DNA，然后再以環化的DNA作為反應模板，根據已知序列來設計反向引物，通過PCR擴增反應來獲得未知片段。韓志勇等（2001）利用I-PCR技術，以轉基因水稻為試驗材料，通過克隆技術獲得了外源基因的側翼序列，并且在一周時間內，通過克隆獲得的35個水稻轉基因株系長度大約在300～750 bp的外源基因的側翼序列。張曉等（2012）采用I-PCR和TAIL-PCR方法從棉花中克隆到了線粒體atpA雙拷貝基因的側翼序列。該方法高效、快速、穩定、簡單便捷，引物設計方便，但是PCR擴增過程容易形成非特異性產物，效率比較低。

1.3 接頭PCR

接頭PCR技術是一種對植物的基因組DNA已知的序列兩側未知序列進行擴增的技術，是繼反向PCR技術之后的又一種克隆啟動子的方法，可以用來對已知的基因序列上游啟動子的序列進行PCR擴增。其原理為：設計一個長鏈接頭和一個與長鏈5’端互補的短鏈接頭，需要在短鏈接頭3’端添加一個NH2，以防止聚合酶在促反應時短鏈進行延伸，再用幾種合適的限制性內切酶對基因組DNA進行酶切反應，然后利用T4連接酶把酶切后得到的DNA片段與合成的接頭引物相連接，以連接后的產物作為PCR擴增反應的模板，以接頭特異性引物（與接頭序列互補）和基因特異性引物（與已知基因5’端序列互補）作為上下游引物進行兩輪的巢式PCR擴增。

圖1 I-PCR原理Triglia等（1998）

圖2 LA-PCR試劑盒流程圖Li等（2005）

Xin等（2012）首先利用限制性內切酶對橡樹的基因組DNA進行酶切，然后經過兩輪的巢式PCR擴增反應后，成功的獲得了6個蔗糖轉運蛋白基因、1個海藻糖合酶基因和1個海藻糖轉化酶基因。根據接頭PCR技術的反應原理，寶生物公司推出了LA-PCRTMin vitro Cloning Kit，其用來對基因側翼的未知序列進行擴增反應，原理如圖2所示。Li等（2005）利用該試劑盒在山葡萄中進行擴增，獲得了幾丁質酶基因VCH3上游的1216 bp啟動子序列。該方法操作簡單便捷，但是擴增產物特異性較差，擴增產物需要進一步雜交驗證。

1.4 熱不對稱交錯PCR

熱不對稱交錯PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）是由Liu等（1995）最早提出的，該方法以基因組DNA為模板，由已知目的基因的5’端序列，設計了3個嵌套引物（sp1，sp2，sp3，20 bp左右）和Tm值較低的隨機簡并引物（AD，14 bp左右）組合，進行3輪PCR反應擴增特異性產物，能夠高效快速地擴增未知序列，試驗流程如圖3所示。Li等（2007）結合了接頭PCR技術和TAIL-PCR技術兩種擴增方法，以遼寧堿蓬的基因組DNA為模板，克隆獲得了SlCMO基因上游的2204 bp的啟動子序列。陳軍營等（2007）以小麥為試驗材料，采用TAIL-PCR方法進行克隆，得到了位于GLP3基因上游的1748 bp處的啟動子的堿基序列。利用TAIL-PCR方法進行克隆，克隆前不需要對基因組DNA模板進行酶切，其優點在于能夠避免產生環化和連接、擴增的產物特異性強、擴增效率高、靈敏度高，已經在分子生物學克隆未知序列的研究中被廣泛應用，但是使用該方法需要較高純度的模板DNA和引物，擴增條件也比較嚴格。

圖3 Genome Walking Kit的實驗流程圖Liu等（1995）

1.5 融合引物巢式PCR

融合引物與巢式聚合酶鏈式反應（fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR），是一種在TAIL-PCR方法原理的基礎上改進的PCR技術（Wang et al. 2011）。在隨機通用引物的5’端連接上接頭序列，使第二輪、第三輪的PCR變成了普通PCR，節省了實驗時間。根據已知基因5’端序列來設計3個特異性的嵌套引物，并與9個特殊設計的隨機簡并引物（AD）混合物相配合，進行第一輪的巢式PCR基于隨機通用引物去設計兩個具有特異性的引物來代替AD，進行第二和第三輪的常規PCR，第二和第三輪的FPNI-PCR是以上一輪的PCR擴增產物稀釋25或50倍為模板，再進行PCR擴增，獲得擴增產物，試驗流程如圖4所示。Zhang等（2013）采用FPNI-PCR方法，在日本落葉松中克隆到了LaTCTP基因的上游的啟動子序列，利用軟件分析結果顯示在體細胞胚胎發育過程中存在很多起調控作用的順式作用元件。李婧等（2016）利用FPNI-PCR技術進行克隆，在大花三色堇中獲得了花青素合成酶（VwANS）基因的上游啟動子序列，并對實驗反應條件進行了優化，實驗結果表明模板的稀釋倍數是根據簡并引物的不同而進行調整，才能擴增到清晰地條帶。FPNI-PCR技術克隆已知基因的側翼序列可以有效的降低非特異性擴增，具有快捷方便、穩定性好、靈敏性高的獲得目的序列的優點，是擴增未知片段的有效技術。

2 誘導型啟動子的功能研究

啟動子本身并不能直接參與基因活動，而是需要通過與轉錄因子相結合才能發揮其作用。

控制基因表達的時間和表達程度。所以，啟動子的功能主要由啟動子中與轉錄因子集合的元件決定。目前，在高等植物誘導型啟動子功能的分析與研究中，常用的方法主要包括生物信息學、瞬時表達分析、點突變、穩定表達分析、酵母單雜技術、凝膠阻滯分析（EMSA）、DNase Ⅰ足跡分析等（Behnam et al. 2013），以及近些年應用的RNAi技術等。

2.1 生物信息學分析

圖4 FPNI-PCR實驗流程圖Wang 等（2011）

利用生物信息學軟件對克隆獲得的啟動子序列進行元件的預測與分析，為今后的啟動子功能研究提供了依據，同時也促進了啟動子的研究效率（Hehl et al. 2001）。目前，能夠對啟動子的功能元件進行預測和分析的常用的數據庫及分析軟件有：

2.1.1 Promoter Scan（http：//www.bimas.dcrt.nih.gov.molbio/proscan）轉錄調控的數據庫（Prestridge 1995）

其主要功能是進行啟動子預測。已經開發了計算機程序PROMOTER SCAN，以識別Pol II啟動子序列的百分比，同時僅允許較小的誤報率。PROMOTER SCAN目前是最好的三個程序識別靈長類啟動子序列，PROMOTER SCAN能夠識別大部分新穎性的提案啟動子序列，同時保持低的假陽性率。

2.1.2 PLACE（plant cis-acting regulatory DNA elements http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE）植物DNA順式調控元件的數據庫（Higo et al.1999）

PLACE能夠總結所查數據的當前地位及可利用的工具。PLACE數據庫中每個基序的文檔包含每個基序的簡要定義和描述，以及可用的PubMed ID號和GeneBank登錄號的相關文獻。用戶可以使用網站上的SingalScan程序的順式作用原件查詢序列。結果將以三種形式之一報告。

2.1.3 Promoter 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter）順式作用元件的數據庫（Knudsen 1999）

Promoter2.0目前已經被開發為和啟動子區域中的序列相互作用的模擬轉錄因子的進化。它建立在神經網絡和遺傳算法常用的原則上。

2.1.4 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）植物順式調控元件（Rombauts et al.1999）

PlantCARE是植物順式調控元件，增強子和阻遏物的數據庫。除了在序列上發現的轉錄基序之外，它還提供了包含完整基因序列的EMBL條目的鏈接以及基序變成功能的條件的描述。

2.1.5 TRANSFAC（transcriptional regulation from patterns to profiles http：//www.gene-regulation.com）轉錄因子的數據庫（Matys et al. 2003）

提供實驗確定的轉錄因子結合位點和位置權重矩陣的最全面的收集。包含轉錄因子數據，靶基因和調控結合位點的TRANSFAC數據庫已被擴展和進一步開發，無論是條目數量以及收集的數據的范圍和結構。表達模式的結構域已被引入人類和小鼠的轉錄因子，使用CYTOMER數據庫在解剖結構和發育階段。

2.1.6 PlantPAN（http：//plantpan2.itps.ncku.edu.tw）用于檢測轉錄因子結合位點的數據庫（Chow et al. 2016）

植物啟動子分析導航器為檢測轉錄因子結合位點（TFBS），相應的TF和其他重要的調控元件（CpG島和串聯重復序列）在植物中的啟動子或一組啟動子中。目前的PlantPAN版本（2.0版）在76種植物中含有16 960個TF和1 143個TF結合位點的基因。

2.2 點突變

點突變分析可以精確定位核心調控元件的位置，可通過轉座子插入突變，或用限制性內切酶酶切特定的功能元件，然后再將插入的突變片段或者啟動子的缺失片段轉入到植物中確定的特定原件。此方法是在研究啟動子的功能元件中經常用到的方法，利用該方法分析獲得的元件主要有TATA-box和CAAT-box。（Khuranan et al. 2013）。

2.3 瞬時表達分析

瞬時表達分析主要是將啟動子連接到報告基因的上游，然后轉化到模式植物中，從而使報告基因能夠在短時間內得到表達，而外源基因則不需要整合到植物的基因組中，而是在脅迫條件下，通過對報告基因表達量的檢測來分析啟動子的活性，（Logemanm et al. 2013；Lu et al. 2013），瞬時表達只能進行定性分析，而不能用作對啟動子誘導活性的檢測，是對啟動子是否具備啟動功能進行驗證的常用方法。

2.4 穩定表達分析

穩定表達分析的原理是將缺失表達片段與將啟動子序列去除的表達載體序列連接構建缺失表達載體，然后通過基因槍法、農桿菌介導法等方法轉化模式植物，進而獲得能夠穩定表達的植株。然后對穩定表達的轉基因植株進行脅迫處理，對報告基因的表達量進行檢測。根據對報告基因表達量的分析，來判斷啟動子的誘導活性和組織特異性的調控元件（Esfandiari et al. 2013）。通過構建不同缺失片段表達載體轉化植物，可以根據報告基因表達量的高低精確地確定順式作用元件的具體位置和作用功能（Alzohairy et al. 2013；Creux et al. 2013）。穩定表達分析是對啟動子的功能研究中最為常用的一種分析方法，能夠確定啟動子的不同區段作用元件的功能，能夠準確地定量分析報告基因的表達量，實驗結果可靠，但是獲得穩定表達的轉基因材料的周期長。

2.5 酵母單雜技術

酵母單雜交技術（yeast one-hybrid）最初是由Li等在酵母雙雜技術的基礎上改進的，根據報告基因的表型來分析啟動子區域作用元件與轉錄因子的相互作用的一項技術。由于酵母單雜交技術檢測特定的轉錄因子與順式作用元件特異性的相互作用的敏感性和可靠性，已被廣泛的用于克隆細胞中含量低的、采用生化純化手段難以純化的轉錄因子（文添龍等，2014）。

2.6 凝膠組織分析

凝膠阻滯分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種能夠簡單并且快速地檢測出蛋白質與特異性DNA序列間結合情況的技術，可以用來對啟動子和特定轉錄因子之間結合情況的檢測，從而能夠確定出啟動子的區域核心作用元件。其作用原理：在凝膠電泳過程中，由于電場正負極的作用，小分子DNA片段向陽極移動的速度比結合了蛋白質的DNA片段的速度更快，因此，根據條帶遷移率的快慢程度就能夠判斷出DNA分子與蛋白質的結合情況。凝膠阻滯分析也是研究啟動子的區域功能元件和轉錄因子之間結合情況的一種重要手段，進而確定出新的作用元件。或者用來驗證已知作用元件與轉錄因子的特異性結合情況。

2.7 DNaseⅠ足跡分析

DNase Ⅰ足跡分析法（DNase footprinting）也是用于研究順式作用元件與蛋白質相互作用的一種方法，該方法能夠精確地確定與蛋白質結合的DNA片段長度及序列（Galas et al. 1978）。其基本原理是用DNase I部分消化已進行單鏈末端標記的待測雙鏈DNA，在變性聚丙烯酰胺凝膠上形成以相差一個核苷酸為梯度的DNA條帶；當DNA片段與其蛋白質特異性結合后，結合蛋白的區域將會受到蛋白的保護，避免受到DNase I的攻擊，因此形成切割梯中的空白區域，再經過DNA化學測序法，就可預測到該結合區的堿基序列。

3 結語與展望

在植物基因的表達過程中，調控基因表達的途徑有很多，其中轉錄水平的調控起著非常重要的作用。在轉錄水平上，由于啟動子區域的順式作用元件和轉錄因子之間相結合，共同參與調控功能基因的表達。因此對于誘導型啟動子來說，在克隆和功能分析的研究越來越受到廣泛的關注。目前對誘導型啟動的研究技術初期階段，將脅迫誘導型啟動子通過基因工程的手段轉入植物，增強植物的抗逆性，但其分子機制卻不清楚。在本文中，簡要的介紹了克隆啟動子的幾種常用的方法以及功能分析的方法，隨著分子生物學技術的逐步發展，將會出現更多的克隆啟動子的方法和應用于啟動子順式作用元件分析的技術，將會發現越來越多的功能元件和轉錄因子，從而提高植物的基因調控過程水平的能力。對了解基因的表達調控模式奠定基礎，為提高轉基因植物的表達效率提供重要的依據。

[1] Tao Y，Wang F T，Jia D M， et al. Cloning and Functional Analysis of the Promoter of a Stress-inducible Gene（ZmRXO1）in Maize[J]. Plant Mol Biol，2014，33（2）：1-9.

[2] Triglia T，Peterson M G，Kemp D J，et al.A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences，Nucleic Acids Research[J].1998，16（16）：81-86.

[3] Han Z Y，Wang X Q，and Shen G Z，Cloning of foreign gene’s flanking sequences in transgenic rice by inverse PCR[N].Shanghai Nongye Xuebao（Acta Agriculture Shanghai），2001，17（2）：27-32.（韓志勇，王新其，沈革志，PCR克隆轉基因水稻的外源基因旁側序列[N]. 上海農業學報，2001，17（2）：27-32）.

[4] Zhang X，zhang R，Sun G Q，et al. High efficiency genome walking method for flanking sequences of cotton mitochondrial double-copy atpA gene based on optimized inverse PCR and TAIL-PCR[N]. Shengwu Gongcheng Xuebao（Chinese Journal of Biotechnology），2012，28（1）：104-115.（張曉，張銳，孫國清，史計，孟志剛，2012，優化的反向PCR結合TAIL-PCR法克隆棉花線粒體atpA雙拷貝基因及其側翼序列[N].生物工程學報，2012，28（1）：104-115）.

[5] Xin L S，YANG，et al. An Improved Promotercloning Method Based on Adaptor-PCR and Its Application in Rubber Tree[J].Bulletin of Botanical Research，2012，32（3）：296-303.

[6] Li H Y，Qi J，Shu H R，et al. Isolation and characterization of a chitinase gene VCH3 promoter from grapevine（Vitis amurensis）[J]. Plant Physiol Mol Biol，2005，31（5）：485-491.

[7] Liu Y G and Whittier R F，et al. Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J]. Genomics，1995，25（3）：674-681.

[8] Li Q L，Yin H，Li D，et al. Isolation and Characterization of CMO Gene Promoter fromHalophyte Suaeda liaotungensis K[J].Journal of Genetics and Genomics，2007，34（4）：355-361.

[9] Chen J Y，Sun P，Wang D Q，et al. An Improved TAIL-PCR Method for Cloning of GLP3 Gene Promoter from Wheat Genomic DNA[J]，Zhiwu Shenglixue Tongxun（Plant Physiology Communications），2007，43（4）：754-758.（陳軍營，孫佩，王德勤，陳新建，2007，一種改良的克隆GLP3基因啟動子的TAIL-PCR技術，植物生理學通訊，43（4）：754-758）.

[10] Wang Z，Ye S，Li J，et al.Fusion primer and nested integrated PCR（FPNI-PCR）：a new high-efficiency strategy for rapid chromosome walking or flanking sequence cloning[J].BMC Biotechnol，2011，11：109.

[11] Zhang L F， Li W F， Han S Y，et al. cDNA cloning，genomic organization and expression analysis during somatic embryogenesis of the translationally controlled tumor protein（TCTP）gene from Japanese larch（Larix leptolepis）[J].Gene，2013，529（1）：150-158.

[12] Li J，Zeng Y，Gong S，Li T G， et al.Optimization of Pansy FPNI - PCR Reaction System[J].Jiangsu Nongye Kexue（Jiangsu Agricultural Science），2016，45（5）：72-75.（李婧，曾媛，龔勝，李霆格，楊文漢，王健，2016，大花三色堇FPNI-PCR反應體系的優化[J].江蘇農業科學，2016，45（5）：72-75）.

[13] Behnam B，Luchi S，Fujita M，et al.Characterization of the promoter region of an Arabidopsis gene for 9-cisepoxycarotenoid dioxygenase involved in dehydration-inducible transcription[J].DNA Res，2013，20（4）：315-324.

[14] Hehl R and Wingender E，Database-assisted promoter analysis[J].Trends in Plant Science，2001，6（6）：251-255.

[15] Prestridge D S，et al. Predicting Pol II promoter sequences using transcription factor binding sites[J].Journal of Molecular Biology，1995，249（5）：923-932.

[16] Higo K，Ugawa Y，Iwamoto M，et al.Plant cis-acting regulatory DNA elements（PLACE）database[J]. Nucleic Acids Res，1999，27：297-300.

[17] Knudsen S，Promoter2.0：for the recognition of PolII promoter sequences[J].Bioinformatics，1999，15（5）：356-361.

[18] Rombauts S，Déhais P，Van M M，Rouzé P，et al. PlantCARE，a plant cis-acting regulatory element database[J].Nucleic Acids Research，1999，27（1）：295-296.

[19] Matys V， Fricke E， Geffers R，et al.TRANSFAC：transcriptional regulation，from patterns to profiles[J].Nucleic Acids Res，2003，31（1）：374-378.

[20] Chow C N，Zheng H Q，Wu N Y，et al.Plant PAN 2.0：an update of plant promoter analysis navigator for reconstructing transcriptional regulatory networks in plants[J].Nucleic Acids Research，2016，44（1）：1154-1160.

[21] Khurana N，Chauhan H，Khurana P，et al.Wheat chloroplast targeted sHSP26 promoter confers heat and abiotic stress inducible expression in transgenic Arabidopsis Plants[J]. Plos One，2013，8（1）：e54418.

[22] Logemann E，Brikenbihl R P，Rawat V，et al.Functional dissection of the PROPEP2 and PROPEP3 promoters reveals the importance of WRKY factors in mediating microbe-associated molecular pattern-induced expression[J].New Phytologist，2013，198（4）：1165-1177.

[23] Lu Y，Chen Y，Wu Y，et al. Directly Transforming PCR-Amplified DNA Fragments into Plant Cells Is a Versatile System That Facilitates the Transient Expression Assay[J].Plos One，2013，8（2）：e57171.

[24] Esfandiari E，Jin Z，Abdeen A，et al.Identification and analysis of an outerseed-coat-specific promoter from Arabidopsis thaliana[J]. Plant Molecular Biology，2013，81（1）：93-104.

[25] Alzohairy A M，Mac Donald M H，Matthews B F，et al. The pJan25 vector series：an enhancement of the Gateway-compatible vector pGWB533 for broader promoter testing applications[J].Plasmid，2013，69（3）：249-256.

[26] Creux N M，Bossinger G，Myburg A A， et al. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase（CesA）promoter regions in woody stem tissues[J].Planta，2013，237（3）：799-812.

[27] Wen T L，Liu X M，Ji Y P，et al. Research Progress of Stress-induced Promoter in Higher Plant[N]. Xibei Zhiwu Xuebao（Acta Bot. Boreal），2014，34（1）：206-204.（文添龍，劉雪梅，冀亞萍，俞嘉寧， 高等植物脅迫誘導型啟動子的研究進展[N].西北植物學報，2014，34（1）：206-204）.

[28] Galas D J，Schmitz A，et al.DNase footprinting a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity[J]. Nucleic Acids Research，1978，5（9）：3157-3170.