鹽酸氯苯胍藥餌給藥條件下在異育銀鯽體內藥動學和組織分布與消除規律

趙留杰，王 元，常曉晴，房文紅，陳進軍，方金龍

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）是我國重要的大宗淡水養殖品種之一，在我國淡水養殖業中具有重要地位。但近年來，由于養殖密度不斷增大等原因，異育銀鯽養殖遭遇到多種病害的侵襲，尤其是粘孢子蟲，可寄生于異育銀鯽的鰓、表皮、喉部、腸、肝等部位，其造成的危害已給產業帶來重大經濟損失［1］。鹽酸氯苯胍（robenidine hydrochloride，ROBH）廣泛用于雞、兔球蟲病的防治，其作用機理主要是干擾蟲體胞漿內質網，影響蟲體蛋白質代謝，使內質網的高爾基體腫脹，氧化磷酸化反應和ATP酶被抑制［1－2］。在2010年的農業部1435號公告中正式被列為國標漁藥，用于水產養殖中防治魚類的孢子蟲病［4］。藥動學和藥物消除規律研究是制定用藥方案和休藥期的基礎。目前，鹽酸氯苯胍藥動學和殘留消除的研究主要集中在雞、兔等動物［5－7］，在水產動物體中僅紅笛鯛（Luthjanus sanguineus）有見報道［3］，檢測方法主要有高效液相色譜法［5，8］、液質聯用法［6－7，9－12］等。然而，鹽酸氯苯胍在缺乏藥物代謝和消除研究的基礎下大量用于異育銀鯽粘孢子蟲病防治，對于藥物能否突破血腦屏障到達靶組織及在可食組織中的殘留情況均不清楚，這既不利于藥物治療，也對水產品質量安全構成一定的風險。我國水產養殖種類繁多，而國標漁藥中規定的用藥方案和休藥期十分籠統，并未考慮魚蝦蟹等不同水產動物之間的差異，亟需更多研究來指導藥物的合理有效使用［13］。本文研究了單劑量藥餌給藥鹽酸氯苯胍在異育銀鯽體內藥動學和鹽酸氯苯胍在異育銀鯽體內的吸收、分布、代謝過程，以及在肝胰臟、肌肉、喉、腎臟、腸、鰓、腦和膽汁中的分布和消除規律，以期為藥物的安全有效使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

鹽酸氯苯胍 （robenidine hydrochloride，ROBH）標準品（純度≥99.5%），購自 Sigma公司；鹽酸氯苯胍原藥（純度≥98.0%），購于浙江匯能生物股份有限公司；甲醇和乙腈（HPLC級），均購自德國默克公司；肝素鈉和甲酸等（分析純），購自國藥集團上海化學試劑公司。

1.2 儀器和設備

高效液相色譜儀（Waters 2695，美國）；紫外檢測器（Waters 2487，美國）；色譜柱為 Aglient Zorbax SB-C18（4.6×150 mm，5μm）（Aglient，美國）；組織研磨儀（SKSI，必橫，中國上海）；超純水儀（Millipore Milli-Q Advantage，美國）；電子分析天平（Mettler Toledo AL204，感量 0.000 1 g，瑞士）；旋轉蒸發器（RE-52A，亞榮，中國上海）；高速冷凍離心機（HITACHI CF16RXⅡ，日本）；微量移液器（Eppendorf，德國）；0.22μm針式過濾器（Anpel，安譜，中國上海）。

1.3 實驗動物

本次實驗模擬水產養殖生產采用投喂藥餌進行給藥，實驗用異育銀鯽購自上海青浦某養殖場，魚體質量（130±20）g，暫養于5 m×3 m×1 m的水泥池，保持24 h充氣并及時排出糞便和殘餌。實驗期間水質的基本參數為：水溫（25±1）℃，水體 pH 7.74±0.06，氨氮（0.40±0.03）mg·L－1，亞硝氮（0.055±0.012）mg·L－1。投喂人工配合飼料，每日2次（上午8∶00和下午16∶00），每次按照魚體重1.5%的投餌率馴化鯽吃食，投喂時間保持在20 min內，暫養2周后用于實驗，實驗期間異育銀鯽成活率為100%。

1.4 給藥和樣品采集

按20 mg·kg－1魚體重的劑量單次投喂含鹽酸氯苯胍的藥餌，藥餌投喂后在15 min內全部被攝食。采樣時間點為在藥餌被全部攝食后1、2、4、6、8、12、24、48、72、120、192、288、384、480、600 h和720 h，每個時間點隨機采集6尾鯽。每條魚尾靜脈采血取1 mL血液置于預先裝有肝素鈉抗凝劑的2 mL離心管中，振蕩混勻后于8 000 r·min－1下離心5 min，取上層血漿于－80℃保存備用。同時在冰浴上迅速采集肝胰臟、肌肉、喉、腎臟、腸、鰓、腦和膽汁于－80℃保存備用。

1.5 樣品前處理

參考劉勇軍等［5］的處理方法，選用乙腈作為提取劑。血漿樣品于室溫融解后，搖勻，吸取400 μL置于2 mL離心管內，加入400μL乙腈，旋渦混合儀劇烈混合2 min，于12 000 r·min－1轉速離心5 min，吸取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾后，用于HPLC分析。

其它組織樣品于室溫解凍后，肌肉、肝胰臟和腸稱取1.00 g，喉、腎臟和鰓稱取0.50 g，腦和膽汁分別取2個樣品混合為一個檢測樣品稱取0.50 g。樣品置于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈及適量不銹鋼珠于均質器中均質（條件：65 hz，100 s）；于9 000 r·min－1轉速離心5 min，收集上清液；殘渣再重復提取兩次，合并3次上清液于100 mL具塞茄形蒸發瓶中，于45℃、真空度0.075 Mpa下旋蒸至干；先加入1 mL流動相再加1 mL正己烷，蓋上塞子置超聲波清洗儀超聲3 min，瓶底殘留物完全溶解，將混合液體轉移至2 mL離心管中，12 000 r·min－1離心5 min，吸取下層液體，經0.22μm微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。

1.6 色譜條件

流動相為：乙腈：0.1%甲酸水 ＝55：45（V／V），柱溫30℃，流速 1.0 mL·min－1，進樣量 20 μL，紫外檢測波長317 nm。

1.7 標準曲線和檢測限

配制濃度分別為10μg·mL－1、5μg·mL－1、2μg·mL－1、1μg·mL－1、0.5μg·mL－1、0.2μg·mL－1、0.1μg·mL－1、0.05μg·mL－1、0.01μg·mL－1鹽酸氯苯胍溶液，過濾膜后上樣，記錄峰面積，以鹽酸氯苯胍濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。

1.8 回收率和精密度測定

在血漿、肝胰臟、肌肉、喉、腎臟、腸、鰓、腦和膽汁組織樣品中添加標準品，使組織中藥物濃度分別為0.10μg·g－1、1.0μg·g－1和 10μg·g－1。每個濃度6個平行，混勻后靜置20 min，按“樣品前處理”方法處理。

1.9 數據處理

藥餌給藥下異育銀鯽血藥濃度－時間關系曲線方程采用房室模型進行擬合分析，血漿的藥動學參數也由房室模型推算。肝胰臟、肌肉、喉、腎臟、腸、鰓、腦和膽汁的藥動學參數采用統計矩原理推算。模型的擬合和藥動學參數的推理采用上海中醫藥大學藥物臨床研究中心的DAS 3.1藥物與統計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 實驗方法驗證

2.1.1 線性范圍和檢測限

鹽酸氯苯胍在0.01～10μg·mL－1范圍內建立的標準曲線線性關系良好，標準曲線回歸方程為y＝60 242x，R2＝0.999 8。以 3倍信噪比計算，檢測限為0.01μg·mL－1。

2.1.2 回收率及精密度

采用加標法測定異育銀鯽各組織中鹽酸氯苯胍回收率，各組織的鹽酸氯苯胍回收率都較高，均在80%以上，血漿則大于95%；精密度由相對標準偏差（RSD）表示，相對標準偏差為2.16%～7.41%，說明樣品處理方法穩定，重現性好，可滿足各組織中樣品的檢測要求。

2.2 藥餌給藥后血漿中鹽酸氯苯胍藥動學

2.2.1 藥餌給藥后血漿中鹽酸氯苯胍濃度－時間曲線關系

20 mg·kg－1鹽酸氯苯胍藥餌給藥后，異育銀鯽血漿中藥物濃度與時間關系曲線見圖1。給藥后血漿中鹽酸氯苯胍濃度快速升高，4 h達到最高，峰濃度（Cmax）為 1.117 mg·L－1；隨后開始快速下降，12 h已經降低到0.310 mg·L－1，接近于峰濃度的1／4，之后進入緩慢消除階段；192 h已經低于0.1 mg·L－1，600 h時血藥濃度接近方法的檢測限 0.01 mg·L－1。

2.2.2 藥餌給藥后鹽酸氯苯胍在血漿中的藥代動力學參數

采用房室模型對血漿中鹽酸氯苯胍濃度與時間關系曲線進行擬合，血藥濃度－時間關系曲線適合采用一級吸收二室模型來描述，擬合的藥動學方程為：

Ct＝0．169e－0．213t＋7．828e－0．211t－8．016 e－0．306t（R2＝0.956）

用房室模型對血漿藥物濃度與時間關系進行藥動學分析，所得參數見表1。

圖1 ROBH藥餌給藥后異育銀鯽血漿中藥物濃度－時間關系曲線（n＝6）Fig.1 Profile of ROBH concentrations in plasma following oral administration of medicated-feed during 0－720 h（n＝6）

表1 鹽酸氯苯胍在血漿中的藥代動力學參數（n＝6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of ROBH in plasma after oral dosing via feed（n＝6）

2.3 藥餌給藥后組織中鹽酸氯苯胍分布與消除規律

2.3.1 藥餌給藥后組織中鹽酸氯苯胍濃度－時間曲線關系

藥餌給藥后，異育銀鯽組織中藥物濃度與時間關系曲線見圖2。肌肉、喉、腎臟、腦、鰓和膽汁的濃度變化趨勢與血藥相似，但組織中鹽酸氯苯胍峰濃度和達峰時間明顯不同，藥物峰濃度分別為 0.431 mg·kg－1、1.170 mg·kg－1、4.641 mg·kg－1、0.824 mg·kg－1、1.383 mg·kg－1和 2.681 mg·kg－1，達峰時間分別為 4 h、8 h、2 h、4 h、4 h和4 h；肝胰臟和腸的濃度變化趨勢相似，藥物峰濃度分別為 3.270 mg·kg－1和 8.529 mg·kg－1，達峰時間均為1 h。

2.3.2 藥餌給藥后鹽酸氯苯胍在組織中的藥代動力學參數

采用統計矩原理求得異育銀鯽肝胰臟、肌肉、喉、腎臟、腸、鰓、腦和膽汁等組織藥動學參數，見表2。鹽酸氯苯胍在異育銀鯽組織中分布較廣，Cmax大小依次為：腸、腎臟、肝胰臟、膽汁、鰓、喉、腦和肌肉；AUC0－∞大小依次：腸、腎臟、膽汁、肝胰臟、喉、鰓、腦和肌肉；t1／2z大小依次為：腦、鰓、腎臟、喉、肝胰臟、膽汁、肌肉和腸。

3 討論

3.1 鹽酸氯苯胍在異育銀鯽血漿中的藥動學

圖2 ROBH藥餌給藥后異育銀鯽組織中藥物濃度－時間關系曲線（n＝6）Fig.1 Profile of ROBH concentrations in tissues following oral administration of medicated-feed during 0－720 h（n＝6）

表2 藥餌給藥后異育銀鯽各組織中鹽酸氯苯胍藥動學參數（n＝6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters of ROBH in Carassius auratus gibelio after oral dosing via feed（n＝6）

本研究中，采用了房室模型對血藥濃度－時間關系曲線進行擬合分析，血漿中鹽酸氯苯胍濃度－時間關系曲線均能很好地采用一級吸收二室開放模型來描述。有關鹽酸氯苯胍在動物體內藥動學的報道較少。李強等［7］完成的鹽酸氯苯胍在兔體內的藥動學及生物利用度研究包括一組以2.00 mg·kg－1單次靜脈注射給藥，另一組以100.00 mg·kg－1單次內服給藥。數據表明該藥靜脈注射后表觀分布容積較大，表示藥物大部分分布于組織，且消除迅速；該藥物的絕對生物利用度僅為7.36%，說明內服鹽酸氯苯胍后，藥物基本不吸收，而是主要以原型排出體外。此外，鹽酸氯苯胍2種給藥方式的各藥動學參數均存在極顯著差異（P＜0.01）。湯菊芬等［3］關于鹽酸氯苯胍在紅笛鯛體內的藥代動力學及殘留消除規律的研究結果顯示，單劑量30 mg·kg－1口灌給藥后，紅笛鯛血漿中鹽酸氯苯胍的藥時數據符合一級吸收二室模型，藥物在血－漿中的達峰時間Tmax為1.79 h，血藥濃度峰值Cmax為 211.38 μg·L－1、藥時曲線下面積（AUC0－∞）為 5 229.16 μg·（L·h）－1、表觀分布容積 Vz為 78.69 L·kg－1、消除半衰期（t1／2β）為 46.99 h。其血漿和組織中的藥時曲線均出現明顯的雙峰現象，作者認為引起該現象的主要原因是肝腸循環和非齊性吸收。在本研究中，鹽酸氯苯胍以20 mg·kg－1單劑量藥餌給藥后，血漿中鹽酸氯苯胍濃度快速升高，4 h達到最高，峰濃度（Cmax）為1.117 mg·L－1，藥時曲線下面積（AUC0－∞）為 68.39 mg·L－1·h，表觀分布容積 Vd為 44.064 L·kg－1、消除半衰期（t1／2β）為 56.86 h。兩者的血藥濃度峰值和藥時曲線下面積數值均不是很高，這可能與兩個實驗的表觀分布容積（Vd）有關：Vd是反應藥物在體內的分布情況，Vd值越大，藥物穿透入組織越多，分布越廣，血藥濃度越低。兩者的消除半衰期數值接近，表明鹽酸氯苯胍在紅笛鯛和異育銀鯽的血漿中的消除速度相近。

3.2 鹽酸氯苯胍在異育銀鯽組織中的分布與治療魚類寄生蟲病的聯系

分析給藥后水產動物組織中藥物濃度，有利于全面了解藥物在動物組織中的分布和消除規律，為制定合理給藥方案和休藥期提供理論依據。湯菊芬等［3］關于鹽酸氯苯胍在紅笛鯛體內的藥代動力學及殘留消除規律的研究結果顯示，單劑量30 mg·kg－1口灌給藥后，鹽酸氯苯胍在紅笛鯛體內組織中藥動學參數Cmax大小依次為：腎臟、肝臟、肌肉；AUC0－∞大小依次為：腎臟、肝臟、肌肉。說明鹽酸氯苯胍口灌給藥時在紅笛鯛體內吸收較為緩慢，藥物多分布于肝臟和腎臟，血漿和肌肉中分布較少。t1／2和MRT0－∞是反映藥物在動物體內消除快慢的重要參數。t1／2依次為：肌肉、腎臟、肝臟，MRT0－∞依次為：肌肉、腎臟、肝臟，說明鹽酸氯苯胍主要分布于腎臟和肝臟，在肌肉中平均駐留時間最長，消除半衰期明顯高于腎臟和肝臟。

在本研究中，經過單劑量20 mg·kg－1鹽酸氯苯胍藥餌給藥后，采集了異育銀鯽的多個組織進行藥動學分析。腸的 Cmax（8.53 mg·kg－1）和AUC0－∞（156.39 mg·kg－1·h）均為各個組織中最大值，而 t1／2z（48.581 h）與 MRT0－∞（53.636 h）均為各個組織中最小值，說明鹽酸氯苯胍經鯽攝食后，首先通過腸道消化吸收。腎臟的 Cmax（4.64 mg·kg－1）、AUC0－∞（122.911 mg·kg－1·h）和 t1／2z（76.541 h）僅次于腸道，且 MRT0－∞（81.953 h）為小于肝胰臟的較大值，說明鹽酸氯苯胍主要是經鯽的腎臟排出體外。肝胰臟的Cmax（3.27 mg·kg－1）和 AUC0－∞（68.444 mg·kg－1·h），膽汁的 Cmax（2.68 mg·kg－1）和 AUC0－∞（83.772 mg·kg－1·h），兩者的參數較為接近且均為各個組織中的較大值，說明肝胰臟和膽都是鹽酸氯苯胍在鯽體內的主要代謝器官。鰓的Cmax（1.38 mg·kg－1）和 AUC0－∞（39.142 mg·kg－1·h）雖然遠小于腸、腎臟、肝胰臟和膽汁，但是要大于肌肉和腦，t1／2z（83.263 h）和 MRT0－∞（93.532 h）僅次于腦，說明鹽酸氯苯胍在鰓中藥物分布并不多，但是持續存在時間較長，鰓可能是鯽的次要排泄器官。喉組織中的 Cmax和AUC0－∞均處于血漿和鰓之間，t1／2z與 MRT0－∞也處于各組織的中間水平，說明鹽酸氯苯胍在喉中具有良好的分布，推測這與喉組織具有較為豐富的血液供給有關。肌肉的Cmax和 AUC0－∞是各個組織中的最小值，t1／2z僅大于腸，說明鹽酸氯苯胍在肌肉中分布較少且消除較快，不會長時間殘留于組織中，可以擁有較短的休藥期。腦組織的Cmax和AUC0－∞表明鹽酸氯苯胍能少量透過血腦屏障［14］進入異育銀鯽腦組織，而腦的 t1／2z與MRT0－∞的數值均為最大的，說明藥物在腦中的消除最慢。比較分析各組織器官的藥動學參數，說明鹽酸氯苯胍經鯽攝食后，經血液循環廣泛分布于組織中，大多數藥物進入腎臟、肝胰臟和膽等進行代謝并排出體外，這也與其較大的Vd值相印證。

在水產養殖生產中，鹽酸氯苯胍已被廣泛運用到防治魚類寄生蟲病，尤其是魚類的孢子蟲病，并取得了較好的治療效果。鯽粘孢子蟲病是鯽養殖區發生最為嚴重的一種病害，主要危害鯽1齡魚種和成魚。孢子蟲主要寄生于鯽的鰓、鱗、鰭、吻、喉、腸、肝、肌肉和腦等部位［1］。其中以寄生在喉部所引起的孢子蟲病危害最為嚴重，主要癥狀是在魚體的咽喉部位形成一個比較大的胞囊，因為直接影響到魚體呼吸和攝食，所以經常引起養殖鯽較高的死亡率。在本研究中，經過單劑量20 mg·kg－1鹽酸氯苯胍藥餌給藥后，孢子蟲的主要病灶鰓、喉、腸、腦和肝胰臟中，均有較高的Cmax和AUC0－∞，保證有效的藥物進入到病灶，t1／2z和 MRT0－∞保證了藥物與孢子蟲的作用時間，理論上是可以達到較好的治療效果。但是此藥物能否通過孢子蟲的孢壁尚不清楚，還需要更為深入的研究。腦組織的Cmax和AUC0－∞表明鹽酸氯苯胍可以透過血腦屏障進入腦組織，而腦的t1／2z與 MRT0－∞的數值均為最大的，說明藥物在腦中的消除最慢。這一方面預示鹽酸氯苯胍可以應用于異育銀鯽腦部寄生蟲疾病的治療，另一方面也提示在臨床使用鹽酸氯苯胍時應考慮其中潛在的風險（例如神經毒性），實際生產中發生的鹽酸氯苯胍藥物中毒事件也印證了這個問題［15］。本研究對江蘇地區的淡水大規模養殖品種異育銀鯽的多個組織進行了藥動學和殘留消除研究，獲得了較為全面的數據，這些實驗數據對該藥物在生產中的科學使用提供了依據和參考。

3.3 鹽酸氯苯胍在異育銀鯽組織中的殘留消除和休藥期

班付國等［6］所作的氯苯胍在雞組織中的殘留消除規律研究，以含氯苯胍500 mg·kg－1飼料飼喂 7 d，停藥后的第 0、1、3、5、7天取其肌肉、肝臟、腎臟、皮和脂肪5種組織。結果表明，氯苯胍在肌肉中殘留量較小，代謝消除比較快；而在脂肪、皮和肝臟中殘留量較大，代謝消除較慢。湯菊芬等［3］關于鹽酸氯苯胍在紅笛鯛體內的藥代動力學及殘留消除規律的研究結果顯示，連續5 d口灌給藥后，紅笛鯛組織中的藥物殘留濃度大小依次為：腎臟、血漿、肝臟、肌肉。消除半衰期t1／2大小依次為：肌肉、肝臟、腎臟、血漿，說明鹽酸氯苯胍在紅笛鯛肌肉中消除最慢。鹽酸氯苯胍主要分布于腎臟和肝臟，在肌肉中平均駐留時間最長，消除半衰期明顯高于腎臟和肝臟。本研究中，經過單劑量鹽酸氯苯胍藥餌給藥后，異育銀鯽體內組織Cmax大小依次為：腸、腎、肝胰臟、膽、鰓、喉、腦、肌肉；t1／2z大小依次為：腦、鰓、腎、喉、肝胰臟、膽汁、肌肉、腸。肌肉的Cmax最小，雖然其t1／2z較高，但是由于較低的藥峰濃度，經過較短的時間，依然可以降低到較低殘留量。鹽酸氯苯胍在異育銀鯽肌肉、肝臟、腎臟的消除半衰期和平均駐留時間均大于紅笛鯛的相應組織，說明鹽酸氯苯胍在海水性魚類紅笛鯛體內的代謝和消除速度快于淡水性魚類異育銀鯽，這可能與它們所處不同鹽度的水環境有關。

目前，國內外均制訂了鹽酸氯苯胍在部分動物源食品中的最高殘留限量。2002年，我國農業部規定鹽酸氯苯胍在雞脂肪、皮及其它可食用組織中的最高殘留限量分別為 200、200、100μg·kg－1［16］。2012年，美國《聯邦規章典集》（Code of Federal Regulations，CFR）第21篇“食品與藥品”（title 21-food and drugs）中的關于鹽酸氯苯胍在雞脂肪、皮及其它可食用組織中的最高殘留限量規定與我國相同［17］。但中國、美國和歐盟等對水產品中鹽酸氯苯胍暫無明確的殘留限量要求［18］。隨著鹽酸氯苯胍在水產養殖中的大量使用，也對水產品質量安全構成一定的風險，因此必須嚴格制定鹽酸氯苯胍的最高殘留限量和休藥期。鹽酸氯苯胍是我國第一批正式轉為國家標準的殺蟲驅蟲漁藥，休藥期規定為500度日［19］。2006年日本實施的肯定列表制度，要求對于未制定最大殘留限量標準的農業化學品在食品中含量不得超過 10μg·kg－1的規定［20］。本研究若以 100 μg·kg－1作為鹽酸氯苯胍在異育銀鯽肌肉中的最高殘留限量，在停藥后24 h，已低于設定的最大殘留限量。若以10μg·kg－1作為鹽酸氯苯胍在異育銀鯽肌肉中的最高殘留限量，在停藥后288 h，已低于設定的最大殘留限量。但鑒于本研究是單次給藥而實際生產中大多為療程多次用藥，且本次實驗未檢測魚皮中的藥物含量，以及考慮到藥物在水產養殖體內消除受養殖環境、健康狀況、水溫等因素的影響，為保證消費者的安全，應將休藥期適當延長。因此，在本實驗條件下，若以10μg·kg－1作為鹽酸氯苯胍在異育銀鯽肌肉中的最高殘留限量，建議鹽酸氯苯胍在異育銀鯽體內的休藥期至少為15 d，這與國家標準漁藥在25℃溫度下20 d的休藥期規定接近。

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