缺氧環境下自噬對內皮祖細胞遷移及凋亡的影響

余森，楊杰，張繼航，黃嵐

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內皮的前體細胞，主要參與了受損內皮的修復。EPCs從骨髓、脾臟等部位動員、遷移、歸巢至血管損傷部位，在多種激素或細胞因子刺激下分化為成熟內皮細胞(endothelial cells，ECs)從而修復損傷血管，其作用在急性心肌梗死、缺血再灌注損傷、糖尿病視網膜病變、肢體缺血等血管病變中均有報道[1]。然而傳統以EPCs移植為基礎的細胞治療，在移植后普遍面臨缺血缺氧等惡劣環境[2]，這導致移植后細胞存活率較低，制約了EPCs移植向臨床的轉化。因而明確EPCs在缺血缺氧等應激狀態下的存活機制，對提高移植治療效果、加強病理狀態下的血管修復有積極的指導作用。自噬(autophagy)作為真核細胞降解胞內蛋白、細胞器的重要方式，對干細胞的發育、分化、存活和歸巢都有重要作用[3-4]。本課題組前期研究發現自噬對氧化應激下EPCs的增殖存活發揮了保護作用[5]，但缺氧環境下自噬對EPCs遷移、凋亡等過程有何作用還有待研究。因此，本實驗旨在觀察缺氧環境下自噬對EPCs遷移及凋亡的影響，初步探討自噬在其中發揮的作用，為缺氧環境下EPCs移植修復血管提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，EGM-2MV培養基購自瑞士Lonza公司，微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、自噬相關蛋白-7(Atg7)抗體、SQSTM1(p62)抗體購自美國Cell Signal Technology公司，β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Santa Cruz公司，淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司，Annexin V-PE和7-AAD染液購自中國凱基生物技術公司。Transwell小室(Corning公司，美國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；細胞培養箱(Kendro公司，美國)；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國)；流式細胞儀(Beckman Coulter公司，美國)。

1.2 EPCs的分離鑒定及培養 成年雄性SD大鼠由新橋醫院實驗動物中心提供。取大鼠脛、腓骨，PBS沖洗后收集骨髓腔沖洗液，密度梯度離心后將分離出的細胞接種于EGM-2MV的培養基中進一步培養。為證實EPCs的表型，我們采用熒光雙染法鑒定EPCs，在培養的細胞中依次加入DiI-acLDL和FITC-UEA-I，通過流式細胞術雙染陽性被確定為EPCs。

1.3 缺氧處理EPCs及分組 分離培養的EPCs每隔24h換液1次，待細胞密度為80%時，常規進行消化傳代。為檢測缺氧對EPCs遷移、凋亡及自噬水平的影響，我們將細胞分為4組：常氧培養組(即缺氧0h組)，缺氧1h組，缺氧3h組和缺氧6h組；為檢測缺氧環境下自噬對EPCs的作用，我們將細胞分為4組：常氧培養組(即缺氧0h組)，缺氧3h組，缺氧3h+沉默Atg7(ShAtg7)組和ShAtg7組。常氧培養條件為：37℃、5%CO2、21%O2、74%N2常氧培養箱中常規培養，缺氧培養條件為：37℃、5%CO2、1%O2、94%N2低氧培養箱中低氧培養。

1.4 流式細胞術檢測凋亡率 按前述實驗分組處理EPCs后，收集各組細胞上清液于對應離心管，PBS洗滌1次后用胰酶消化貼壁細胞1min，加入完全培養基終止消化，收集培養液與對應組的上清液細胞混合，1000×g離心3min，PBS洗滌2次后制備細胞懸液，加Annexin V-PE(AV-PE)和7-AAD染色，流式細胞儀檢測各組EPCs凋亡率。

1.5 Western blotting檢測 收集各組細胞，預冷PBS洗滌3次，加入細胞裂解液，離心后提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定樣本蛋白質濃度。按每泳道50μg上樣量，進行10% SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，加入一抗在4℃條件下孵育過夜(一抗采用LC3、p62和β-actin，1:1000)，TBST洗滌3次，加入二抗標記有辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(1:5000)，37℃室溫孵育1h，TBST洗滌3次，ECL顯影，利用Image J軟件進行半定量分析。

1.6 自噬相關蛋白Atg7沉默 慢病毒載體(LV) Atg7 shRNA由漢恒生物技術(上海，中國)構建。在骨髓來源的單核細胞(BMNCs)播種2d后，按照感染復數(multiplicity of infection，MOI)為100加入病毒。轉染液培養基在48h后換為新鮮培養基繼續培養。Western blotting檢測分為空白對照組(control)、空載組(vector control，VC)及ShAtg7組，以期驗證EPCs中Atg7的敲減效率。

1.7 Transwell侵襲小室實驗 取對數生長期的EPCs，調整細胞密度為3×104個/ml，在鋪好膠的上室中加入200μl細胞懸液(不含血清)，下室加入500μl含VEGF的EGM-2培養液，每組設3個復孔，按前述實驗分組對EPCs進行孵育。孵育結束后從小室取出各組EPCs，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗滌細胞3次，結晶紫染色10min，倒置顯微鏡下計數細胞數并拍照，隨機選擇視野進行統計分析。

1.8 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析。實驗數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，實驗重復≥3次。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 缺氧對EPCs遷移能力的影響 取缺氧0、1、3、6h分組處理EPCs后，利用經典的Transwell小室遷移實驗比較各組EPCs遷移能力的變化。結果顯示，隨著低氧暴露時間的延長，EPCs遷移能力逐漸降低。常氧培養組(即缺氧0h組)，顯微鏡下平均每視野EPCs為50.6±5.2個，缺氧培養3h后平均每視野EPCs減少為36.60±3.36個(P<0.05)，缺氧培養6h后平均每視野EPCs進一步減少為28.80±4.38個(P<0.05，圖1)。

2.2 缺氧對EPCs凋亡的影響 我們用Annexin V-PE(AV-PE)和7-AAD雙染色標記細胞，并采用流式細胞儀檢測各組EPCs凋亡水平。結果顯示，隨著低氧暴露時間的延長，EPCs凋亡率逐漸升高。常氧培養組(即缺氧0h組)凋亡率為3.87%±0.55%，缺氧3h后凋亡率(6.85%±0.91%)明顯升高(P<0.05)，缺氧6h后凋亡率(9.60%±0.78%)較缺氧0h組進一步升高(P<0.05)，與缺氧3h組相比凋亡率也有明顯升高(P<0.05，圖2)。

圖1 缺氧對EPCs遷移的影響(Transwell小室)Fig.1 Influence of hypoxia on EPCs migration (Transwell chambers)

圖2 缺氧對EPCs凋亡的影響(流式細胞儀)Fig.2 Influence of hypoxia on EPCs apoptosis (Flow cytometry)

2.3 缺氧對EPCs自噬的影響 Western blotting檢測結果顯示，隨著缺氧時間的延長，EPCs自噬關鍵蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增大，在缺氧3h后差異有統計學意義(P<0.05)，自噬泛素化底物p62逐漸減少，在缺氧3h后差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。根據遷移和凋亡結果，結合文獻[6]報道，后續研究我們采用1%氧濃度培養3h作為缺氧模擬條件。

2.4 缺氧激活的自噬在EPCs遷移和凋亡中作用我們采用慢病毒轉染方式穩定沉默自噬蛋白Atg7，Western blotting驗證Atg7被成功敲除，空載組(vector-control，VC)Atg7表達差異無統計學意義(P>0.05)，LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達變化證實沉默Atg7后自噬被成功抑制(圖4A、B)。我們再次利用流式細胞儀分析抑制自噬后細胞凋亡率的改變，結果顯示，缺氧3h組EPCs凋亡率(6.68%±0.95%)與缺氧0h組(3.45%±0.79%)比較明顯升高(P<0.05)；缺氧3h+ShAtg7組EPCs凋亡率(8.41%±1.08%)與缺氧3h組相比，凋亡率進一步升高(P<0.05，圖4C、D)。

同時，我們利用Tanswell小室再次檢測抑制自噬后細胞遷移數目的改變，結果顯示，缺氧3h組EPCs遷移數目(34.00±3.53)明顯低于缺氧0h組(47.80±7.50，P<0.05)，缺氧3h+ShAtg7組EPCs遷移數目(23.60±3.51)與缺氧3h組相比，EPCs遷移數目進一步減少(P<0.05，圖5)。

圖3 缺氧對EPCs LC3-Ⅱ/Ⅰ及p62表達的影響(Western blotting)Fig.3 Influence of hypoxia on the expressions of LC3-Ⅱ/Ⅰ and p62 (Western blotting)

圖4 沉默Atg7表達后缺氧對EPCs凋亡的影響Fig.4 Influence of hypoxia on EPCs apoptosis after silencing Atg7 expression

圖5 沉默Atg7表達后缺氧對EPCs遷移的影響(Transwell小室)Fig.5 Effects of hypoxia on EPCs migration after silencing Atg7 expression (Transwell chamber)

3 討 論

本研究結果表明，缺氧環境下大鼠骨髓來源的EPCs遷移能力下降，細胞凋亡率升高，同時，缺氧使EPCs內LC3-Ⅱ/Ⅰ表達增高，p62表達降低，證實缺氧是自噬的重要激活因子[7]。沉默Atg7抑制自噬后發現，與缺氧3h組比較，缺氧3h+ShAtg7組的EPCs遷移能力進一步降低，細胞凋亡率進一步升高，說明自噬在缺氧造成的損傷中發揮了保護作用。EPCs遷移和凋亡都受到自噬的影響，因此，缺氧在抑制EPCs遷移、增加細胞凋亡的同時，激活的自噬可降低缺氧對EPCs的損傷，恢復部分EPCs遷移并減少凋亡，增加EPCs的存活率。

在人體的大部分組織中，氧濃度低于3%被視為是一種低氧環境[8]，本研究采用的是1%氧濃度的低氧培養箱處理細胞，由于長期缺氧可導致細胞大量死亡，使自噬作用難以體現，因此本研究采用短期缺氧處理1、3、6h后觀察EPCs遷移能力及凋亡數目變化。文獻報道處于胚胎期及骨髓內的EPCs常處在低氧狀態[9]，當血管受損等發生時，EPCs動員至損傷處分化為內皮細胞，缺氧可以明顯增強缺氧誘導因子(HIF-1α)、趨化因子受體4(CXCR4)、VEGF等因子的表達，從而提高EPCs遷移、分化、增殖能力[6]，因此缺氧預處理EPCs可增強細胞的抗凋亡能力。但是，缺氧預處理對EPCs生物學功能影響的最佳時間條件不甚明確，這可能與體內缺氧環境有多種神經體液調節共同作用有關。本實驗中，使用1%氧濃度缺氧處理3h后即對EPCs的遷移及凋亡產生明顯影響，說明體外環境下短期低氧處理即可激活EPCs凋亡通路并抑制遷移相關蛋白，使EPCs遷移能力減弱，凋亡增加。

自噬作為一種應激調控機制，在維持細胞正常功能中發揮著重要作用。既往研究表明適度激活的自噬可促進清除損傷的細胞器、細胞內代謝產物及突變基因，以延長細胞壽命[10]。近年來自噬與心血管疾病的聯系逐漸受到關注，尤其在缺氧缺血性血管疾病、缺血再灌注損傷[7,11]等疾病中受到廣泛研究，但自噬對于缺氧環境下EPCs的作用還有待進一步研究。目前關于缺氧激活細胞自噬的途徑主要集中在對HIF-1α的研究上[12]，HIF-1α被認為是缺氧激活自噬的始動因子。Wang[13]的研究指出，由HIF-1α介導的自噬可增加細胞凋亡及氧化應激反應，并且這種損傷可被自噬抑制劑3-MA所阻斷。BNIP3/BNIP3L是缺氧誘導自噬發生的重要分子，缺氧時HIF-1α能使BNIP3/BNIP3L表達增加，競爭性地使Beclin-1從Bcl-2/Beclin-1復合體中解離并釋放，Beclin-1通過PI3K/AKT途徑調節下游多種自噬相關蛋白，從而激活缺氧誘導的自噬[11]。另外嚴重的缺氧可造成細胞內線粒體畸形和損傷，使線粒體內鈣超載，同時產生并釋放活性氧(ROS)、細胞色素C等物質，上調細胞凋亡蛋白酶(caspase)，促進細胞凋亡或壞死[14]，而自噬能清除受損線粒體及蛋白質，降低ROS細胞毒性，并維持細胞內能量穩定。上述為缺氧激活細胞自噬過程中可能存在的幾種途徑，在EPCs中仍有待進一步研究。

缺氧激活的自噬與細胞凋亡及遷移聯系緊密。研究發現缺氧環境下AKT和NF-κB通路對調控EPCs遷移和內皮分化發揮著重要作用[15]，同時細胞自噬與凋亡存在共同通路，例如通過PI3K/AKT/mTOR途徑調節細胞凋亡與自噬，且PI3K/AKT/eNOS途徑對EPCs動員、遷移及分化都發揮著重要作用[16]。適度的低氧可激活自噬，清除細胞內的變形蛋白及衰老細胞器并提供細胞代謝所需的原材料，促進細胞在缺氧環境下的生存。然而，當缺氧暴露時間持續延長或程度加重時，自噬將被過度激活，細胞將出現自我消化，進一步導致細胞自噬性死亡或者凋亡[17-18]。因此，自噬作為一把雙刃劍，在保護細胞的同時也可能對細胞產生不良影響。在本研究中，我們并未采用傳統自噬誘導劑如mTOR抑制劑(雷帕霉素)、IP3R阻滯劑[19](Xestospongin C)，因為此類自噬誘導劑常造成細胞自噬激活過度，引起細胞內細胞器及蛋白過度降解，導致細胞自噬性死亡或者凋亡的發生[20]，從而掩蓋自噬對細胞的保護性作用。在后續的研究中，我們將進一步篩選及探討激活自噬的藥物，通過調控適度的自噬從而達到保護應激環境下EPCs生物學功能的作用。

綜上所述，本研究證實，缺氧可減弱EPCs的遷移能力并增加細胞凋亡，同時可激活EPCs自噬。通過適度正向調控EPCs自噬，可增強細胞遷移、抑制凋亡，從而提高EPCs生存能力。該結果將有助于為缺血再灌注損傷、缺血缺氧性心血管病等疾病治療提供一種新的策略，也為后續的深入實驗研究奠定了基礎。

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