紫花苜蓿高效共生固氮根瘤菌的篩選

楊淑君，何永攀，張學(xué)洲，蘭吉勇，張薈薈，柯梅

（1.新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師三坪農(nóng)場(chǎng)，烏魯木齊 830000）

根瘤菌是作為廣泛地分布在土壤當(dāng)中的一類(lèi)革蘭氏的陰性細(xì)菌[1-2]。根瘤菌能夠侵染豆科植物的根部，并在其根部形成根瘤[3]。對(duì)空氣當(dāng)中分子態(tài)的氮進(jìn)行固定以形成氨類(lèi)，從而為豆科植物提供起氮素的營(yíng)養(yǎng)支持。根瘤菌和豆科植物的和諧共生是自然界當(dāng)中生物固氮的一個(gè)最強(qiáng)體系[4]。其所固定氮占生物的固氮總量超過(guò)65%。當(dāng)前全世界的各種類(lèi)的蛋白食物當(dāng)中，約有超過(guò)20%是源于豆科植物[5]。在我國(guó)已知的豆科植物種類(lèi)大概接近1400種。其中從草本豆科到喬木豆科，豆科植物的生態(tài)、形態(tài)以及其生活習(xí)性都具有多樣化。其中的大部分也都可以為根瘤菌所感染并且在根部結(jié)瘤。根瘤菌的固氮不僅可以提高對(duì)豆科植物的產(chǎn)量，改善植物的品質(zhì)，同時(shí)也可以節(jié)約氮肥并且降低生產(chǎn)的成本，同時(shí)提高土壤的肥力，改善土壤的結(jié)構(gòu)等效果。根瘤菌的作用為該土地的后茬作物充分的提供了純天然的氮素營(yíng)養(yǎng)。但是根瘤菌也并不意味對(duì)于所有的寄主豆科植物都能實(shí)現(xiàn)提高其宿主的產(chǎn)量或者品質(zhì)。根瘤菌的結(jié)瘤過(guò)程是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程，有眾多的因素都影響著根瘤菌的結(jié)瘤以及其與宿主植物的共生同氮的效率。眾多因素也包括了土壤的條件、土壤中的土著種根瘤菌、宿主植物的品種、植物和根瘤菌相互的作用等等。因此，對(duì)于豆科宿主植物與其根瘤菌的共生固氮優(yōu)良組合的篩選，在一直以來(lái)也是生物固氮這一研究領(lǐng)域的一個(gè)重要熱點(diǎn)。

紫花苜蓿不僅能為我國(guó)的草地、畜牧業(yè)發(fā)展供給重要、優(yōu)質(zhì)的蛋白類(lèi)飼料，且由于有固氮菌的固氮作用，其也能起到土壤培肥，對(duì)生態(tài)環(huán)境進(jìn)行改善作用，從而對(duì)提高中低產(chǎn)田利用率起到明顯的作用。本文通過(guò)研究紫花苜蓿接種的8株根瘤菌，在溫室的條件之下生長(zhǎng)情況以及其結(jié)瘤的具體狀況，篩選出具備最佳的共生匹配關(guān)系的固氮根瘤菌的菌株。以實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)的效果，且為紫花苜蓿的高效固氮根瘤菌篩選的理論依據(jù)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

紫花苜蓿，由本所昌吉綜合試驗(yàn)站種植并供種。

1.1.2 供試菌株

固氮菌株由我所前期項(xiàng)目篩選保存根瘤菌。

表1 8株供試菌株表

1.1.3 土壤

X牧區(qū)試驗(yàn)地的表土（該廠種過(guò)相關(guān)的豆科牧草，且前茬為禾本科的草本植物），本研究選用的土壤為普通壤土，同時(shí)土質(zhì)相對(duì)均勻一致，土壤中pH 8.2，全氮含量 0.062%。

1.1.4 培養(yǎng)基

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室自制固體培養(yǎng)基（l l蒸餾水、瓊脂粉 15 g、甘露醇 10 g、K2HPO4為 0.25 g、KH2PO4為 0.25 g、MgSO4為0.2 g、NaCl為0.1 g、CaC03為3 g），pH控制 6.8～7.2 之間。

1.2 方法

1.2.1 活化根瘤茵

8株供試菌株分別接種于克氏瓶中培養(yǎng)基上，28℃溫度下培養(yǎng)2 d至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后那個(gè)100 ml的無(wú)菌水對(duì)菌體洗下并裝入到無(wú)菌的三角瓶當(dāng)中。通過(guò)旋渦振蕩法打散菌體之后取其中的一部分測(cè)定OD值，之后使每毫升的菌懸液當(dāng)中根瘤菌個(gè)數(shù)達(dá)到20億。

其中的計(jì)算公式為：根瘤菌數(shù)=各方格中根瘤菌數(shù)的平均值/16*4000*1000*稀釋倍數(shù)。

1.2.2 種子的處理與根瘤菌的接種

紫花苜蓿種子經(jīng)過(guò)濃度 95%的乙醇進(jìn)行處理10 min后。在無(wú)菌水下5～6次沖洗后再用濃度0.1%HgCl表面消毒，再在無(wú)菌水下5～6次并置于培養(yǎng)皿當(dāng)中，于28℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行2 d培養(yǎng)催芽。后于培養(yǎng)基中加入備用菌懸液，再加發(fā)芽一致，根的長(zhǎng)約為1 cm紫花苜蓿種子，進(jìn)行浸泡達(dá)15 min后用鑷子進(jìn)行夾取，并植入裝一定土壤塑料花盆種植。該方法分別對(duì)8種各不同的根瘤菌接種進(jìn)行處理，每中各做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并以不進(jìn)行接種植株作為對(duì)照，同樣3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)一培養(yǎng)。

1.3 測(cè)定接種效果

在接種的45 d之后進(jìn)行收獲。將紫花苜蓿的地上部（第一片子葉的葉痕處上端）剪下后，分別進(jìn)行裝袋，處理稱(chēng)干重；收獲時(shí)再把紫花苜蓿根系用水進(jìn)行洗凈，測(cè)每盆植株的總根瘤數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件結(jié)合EXCEl表格進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果分析

2.1 紫花苜蓿接種后生長(zhǎng)的效應(yīng)

紫花苜蓿接種8株不同的根瘤菌之后，其干草重與對(duì)照間差異顯著(P＜0.05)，其中（ACCC04、ACCC03和ACCC05）的菌株干草重顯著的高于其他的處理。其中增幅最大的是ACCC04，干草重達(dá)3.72 g，高于對(duì)照26.33%。增幅最小為ACCC08。高于對(duì)照3.82%，在接種了根瘤菌后，對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)影響不明顯，只有ACCC05存在顯著差異，其他的菌株間均無(wú)明顯的差異，但8個(gè)處理的干根重均顯著大于對(duì)照，說(shuō)明根瘤菌的接種對(duì)于紫花苜蓿生長(zhǎng)具一定的促進(jìn)作用。

2.2 紫花苜蓿接種后固氮效應(yīng)

接種了根瘤菌之后，能顯著的提高了紫花苜蓿結(jié)瘤的能力。接種了根瘤菌后紫花苜蓿結(jié)瘤的能力也存在差異，其中31菌株根瘤數(shù)最多，其次是ACCC08和ACCC05根瘤數(shù)，比對(duì)照增加41.33%、29.43%與25.43%。而根瘤數(shù)增加最少的菌株是ACCC04，對(duì)比對(duì)照僅為3%。

上述的定指標(biāo)：接種ACCC 44根瘤菌后紫花苜蓿的效果最佳。可有效的增加紫花苜蓿的產(chǎn)草量。是紫花苜蓿最佳的一個(gè)匹配菌株。

3 討論

本研究選取8株根瘤菌對(duì)紫花苜蓿接種，8株根瘤菌的接種效果存在明顯的差異；在接種之后的干草重、根瘤數(shù)與對(duì)照相比分別各增加3.82%～26.33%、3.00%～41.33%；篩選出與紫花苜蓿最佳的共生匹配的固氮根瘤菌ACCC05，該固氮根瘤菌菌株能夠顯著的增強(qiáng)其固氮效果，在提高草產(chǎn)量選擇該固氮菌具一定生產(chǎn)與應(yīng)用的價(jià)值。

[1] 韓志順，鄭敏娜，梁秀芝．接種不同根瘤菌對(duì)紫花苜蓿固氮效能及生物量的影響[J]．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31(4):214-219．

[2] 朱秋蓮，邢肖毅，程曼，等．寧南山區(qū)典型植物根際與非根際土壤碳、氮形態(tài)[J]．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24(4):983-988．

[3] 孫向輝，騰應(yīng)，駱永明．接種根瘤菌對(duì)紫花苜蓿吸收轉(zhuǎn)運(yùn)PCB28及抗PCB28污染能力的影響[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43(3):65-69.

[4] 王軍．不同施肥水平下接種AMF和根瘤菌對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)及養(yǎng)分吸收的影響[D]．北京：北京林業(yè)大學(xué)，2012．

[5] 楊何寶，李繼泉，王俊娟，等．施肥和苜蓿接種根瘤菌對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及鐵尾礦砂基質(zhì)理化性質(zhì)的影響[J]．草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25(2):68-76．