擴(kuò)心方對擴(kuò)張型心肌病大鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶及受磷蛋白的影響＊

樊 華，楊愛玲，王佑華，彭瓏萍，叢麗燁，苑素云，曹 敏，鄧 兵，周 端

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200032）

擴(kuò)張型心肌病（Dilated cardiomyopathy，DCM）屬原發(fā)性混合型心肌病的一種[1]，國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)DCM的5年病死率為15-50%。該病主要表現(xiàn)為左心室、右心室或雙側(cè)心室增大，伴有心肌肥厚，心肌收縮功能減退，伴或不伴有心力衰竭（Heart Failure，HF）。臨床主要表現(xiàn)為低射血分?jǐn)?shù)值、進(jìn)行性心衰、惡性心律失常、血栓栓塞、心源性休克及猝死等，并可發(fā)生于疾病發(fā)展過程中的任何階段[2]，是導(dǎo)致心衰的主要病因之一[3]。治療集中在抗心衰、抗心律失常及抗凝等對癥治療，缺乏針對性的治療，而中醫(yī)對該病的治療在調(diào)整心功能、改善臨床癥狀及提高生存率等方面有一定的優(yōu)勢[4]。諸多研究表明，心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度或鈣穩(wěn)態(tài)對心肌舒縮功能起著重要的調(diào)節(jié)作用，心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA2α）及受磷蛋白（PLB）等作為肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控相關(guān)蛋白，對此過程發(fā)揮著重要的作用，故對這一環(huán)節(jié)的深入研究，對闡明DCM發(fā)病機(jī)制、提高DCM的臨床療效具有重要意義。

擴(kuò)心方是我院周端教授的經(jīng)驗(yàn)方，該方由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮、黃荊子等中藥組成，在臨床上用于治療擴(kuò)張型心肌病多年，長期作為院內(nèi)協(xié)定方應(yīng)用于臨床擴(kuò)心病治療。前期[5]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)心方可明顯改善心功能及臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量，收到良好效果，但其作用機(jī)制不明，有待深入研究價(jià)值。本研究通過觀察擴(kuò)心方對阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病模型大鼠心功能、心肌病理及心肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控相關(guān)基因、蛋白的影響，初步探討擴(kuò)心方治療擴(kuò)張型心肌病的作用機(jī)制，為擴(kuò)心方研究與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠60只，SPF級(jí)，體重（200±20）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)條件：室溫22-24℃，相對濕度50%-60%，12 h/12 h明暗。

1.2 儀器與藥物

1.2.1 儀器

GEViVid7型超聲儀及12 L高頻淺表探頭（美國通用電氣公司）、RM2016病理切片機(jī)（德國Leica公司）、7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、Rt2100c酶標(biāo)檢測儀（中國Rayto公司）、neofuge 13R冷凍離心機(jī)（中國力康公司）、日本尼康光學(xué)顯微鏡。

1.2.2 藥物

阿霉素（ADR）（深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):1703E1;規(guī)格:10 mg/瓶），4℃保存；擴(kuò)心方（由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮、黃荊子等組成，以水煎煮、真空濃縮、噴霧干燥、干式制粒）臨用前用蒸餾水溶解;卡托普利為中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字H31022986）；戊巴比妥鈉，4%多聚甲醛溶液，蘇木素-伊紅染液，RNA提取液（塞維爾生物科技有限公司，貨號(hào)G3013），SERCA2a、PLB、GAPDH引物（擎科創(chuàng)新生物科技有限公司，貨號(hào)分別為NM_001110139.2、NM_001110139.2、NM_001110139.2），兔抗大鼠SERCA2a、PLB、GAPDH抗體（Abcam公司，貨號(hào)分別為ab150435，ab85146，ab181602），HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（CST公司，貨號(hào)7074S）。

1.3 分組與造模

動(dòng)物在屏障系統(tǒng)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為6組（n=10）:即正常組，模型組，擴(kuò)心方低、中、高劑量組及卡托普利組。根據(jù)常規(guī)DCM大鼠模型制備方法[6]，將ADR用生理鹽水配成1 mg·mL-1溶液，50只造模大鼠均腹腔注射ADR2.5 mg/(kg·week)，正常組10只大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，共6周（阿霉素的累積劑量達(dá)到15 mg·kg-1）。造模前各組隨機(jī)取3只做心臟超聲，檢測左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室舒張期末徑（left ventricular internal diastolic diameter，LVIDD）、左室收縮期末徑（left ventricular internal systolic diameter，LVIDS）、左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S），各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。注射ADR 4周后，60只大鼠均做心超，造模組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即造模成功。

1.4 給藥

從注射ADR第5周開始灌胃給藥，根據(jù)體表面積換算法換算法得出：卡托普利組劑量為5 mg/kg/天，用蒸餾水配成10 mg·mL-1溶液；擴(kuò)心方中劑量為3.6 g/kg/天，低劑量為中劑量的1/2，即1.8 g/kg/天，高劑量為中劑量的2倍，即7.2 g/kg/天，用蒸餾水配成1 g·mL-1的溶液；正常組和模型組給予與中劑量組等量的生理鹽水，每天上午灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

1.5 指標(biāo)檢測及方法

1.5.1 超聲心動(dòng)圖檢測

分別在造模前、造模4周后及給藥4周后，大鼠使用氣體麻醉系統(tǒng)進(jìn)行麻醉，取仰臥位，心前區(qū)備皮，采用多功能超聲診斷儀，用頻率為6-12 MHz的探頭進(jìn)行檢測。取胸骨旁左室長軸切面、心臟四腔切面和M型超聲心動(dòng)圖，分別測量LVIDD、LVIDS、EF、FS，取3個(gè)心動(dòng)周期求平均值。

1.5.2 病理學(xué)檢測

以戊巴比妥鈉按40 mg·kg-1對大鼠進(jìn)行麻醉，開胸取心臟后，分離左心室部分，將其分為心尖部與心底部，心尖部組織置于-80℃冰箱保存中用于PCR、Western blotting檢測；心底部組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，進(jìn)行脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色觀察心肌組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.5.3 SERCA2α及PLB mRNA表達(dá)水平的RT-PCR半定量測定

SERCA2α、PLB、GAPDH（內(nèi)參照）引物序列間表1。取-80°保存的大鼠心尖部組織剪成100 mg左右大小組織塊，采用Trizol一步法提取mRNA，測定其濃度后，按二步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

1.5.4 SERCA2α及PLB蛋白表達(dá)水平的Western-blot半定量測定

取100 mg左右組織塊提取蛋白。以BCA蛋白定量試劑盒定量各組蛋白濃度；進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白;將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉；分別孵育兔抗大鼠SERCA2α多克隆抗體（1∶1 000）、PLB多克隆抗體（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體4℃過夜；最后用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育2 h。使用ECL顯色試劑盒曝光顯影。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列及擴(kuò)增條件

表2 各組心臟超聲比較（s）

表2 各組心臟超聲比較（s）

與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

FS(%)52.66±8.58 31.10±4.47#40.75±5.92*39.50±6.97*42.36±8.69*34.98±2.65*組別正常組模型組擴(kuò)心方低劑量擴(kuò)心方中劑量擴(kuò)心方高劑量卡托普利組n 10 7 9 1 0 9 9 LVIDD(mm)6.64±0.54 7.78±0.39#7.34±0.27 7.22±0.70 6.52±0.74*6.95±0.35*LVIDS(mm)3.34±0.70 5.22±0.33#3.95±0.57*3.99±0.36*3.84±0.71*4.71±0.27*EF(%)82.55±6.38 56.97±6.43#69.83±7.14*66.70±7.35*71.16±9.86*62.48±3.52*

圖1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）方式表示，兩組均數(shù)比較用配對t檢驗(yàn)分析，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

隨著給藥劑量的累積，注射ADR的大鼠逐漸出現(xiàn)精神不振，毛發(fā)雜亂，體重增加減慢等表現(xiàn)，第4周開始，部分大鼠出現(xiàn)腹水，腹瀉；正常組大鼠反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，體重增長迅速；第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組和擴(kuò)心方中劑量組全部存活，擴(kuò)心方低、高劑量組及卡托普利組均死亡1只，模型組死亡3只。死亡大鼠行尸體解剖發(fā)現(xiàn)，存在肝大、胸水、腹水、腹腔內(nèi)臟器粘連等現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果比較

各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果比較（表2，圖1）與正常組相比，模型組的大鼠LVIDD及LVIDS值升高，EF及FS值降低（P＜0.05），提示造模成功；與模型組大鼠相比，擴(kuò)心方高、中、低及卡托普利組大鼠LVIDD、LVIDS值降低，EF、FS值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞病理學(xué)改變比較

各組大鼠心肌細(xì)胞病理學(xué)改變比較（圖2）HE染色（圖2A）可見，正常組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)無增生。模型組（圖2B）出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大，間質(zhì)增生，炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列紊亂，局部斷裂，有出血和炎癥等病理改變。經(jīng)過治療后，各組染色（圖2C-F）可見心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)增生、炎癥細(xì)胞浸潤、排列紊亂等表現(xiàn)均較模型組有所改善。上述病理表現(xiàn)提示擴(kuò)心方治療對于心肌重塑有改善作用，可有效緩解DCM心肌肥大、壞死、纖維化等改變。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞病理學(xué)改變比較

2.4 各組大鼠SERCA2α及PLB mRNA表達(dá)比較

各組大鼠SERCA2α及PLB mRNA表達(dá)比較（圖3）與正常組相比，模型組SERCA2α的mRNA水平顯著下降（P＜0.05），經(jīng)擴(kuò)心方各劑量及卡托普利干預(yù)后，DCM大鼠SERCA2α的mRNA水平均顯著升高（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）；模型組PLBd的mRNA水平較正常組顯著上升（P＜0.05）;而經(jīng)治療后，PLB的mRNA水平顯著降低（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）。

圖3 各組大鼠SERCA2α及PLB mRNA表達(dá)比較

2.5 各組大鼠SERCA2α和PLB蛋白表達(dá)比較

圖4 各組大鼠SERCA2α和PLB蛋白表達(dá)比較

各組大鼠SERCA2α和PLB蛋白表達(dá)比較（圖4）在分子量100 kD、74 kD處可見清晰的表達(dá)條帶。與正常組相比，模型組的SERCA2α條帶明顯變淡變細(xì)，而PLB條帶則增粗，經(jīng)擴(kuò)心方各劑量及卡托普利治療后，條帶分別有不同程度改變。進(jìn)一步半定量分析顯示，模型組中SERCA2α表達(dá)量較正常組降低（P＜0.05），而擴(kuò)心方各劑量及卡托普利組較模型組SERCA2α表達(dá)量則顯著升高（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）；模型組中PLB表達(dá)量較正常組升高（P＜0.05），而擴(kuò)心方各劑量組較模型組PLB表達(dá)量則顯著降低（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）。

3 討論

周端教授提出擴(kuò)張型心肌病乃先天稟賦不足、后天失養(yǎng)、久病體虛等因素交互作用，導(dǎo)致氣陰虧虛、或陽氣虛衰，心脈痹阻，血運(yùn)不暢，心體脹大，久則血不利而為水，血瘀痰水停留，亦使心體脹大，從而發(fā)為本病。治以益氣養(yǎng)陰、溫通陽氣，佐以活血化痰利水，設(shè)擴(kuò)心方加減治療，基本方由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮、黃荊子等組成。全方從整體觀念出發(fā)，標(biāo)本兼治，黃芪、黃精補(bǔ)益心氣、納氣平喘、滋陰填精以為君;丹參、瓜蔞皮行氣寬胸、活血化瘀以為臣;再佐以桂枝溫陽利水，黃荊子行氣滌痰平喘。擴(kuò)心方臨床研究表明，其對擴(kuò)張型心肌病患者的癥狀及心功能改善均有較好的作用，優(yōu)于單純西藥治療，明顯提高生活質(zhì)量。并且部分患者再入院率明顯下降，提示遠(yuǎn)期療效較好。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用ADR腹腔注射致DCM模型，并予擴(kuò)心方干預(yù)治療。

心肌功能障礙是DCM發(fā)生發(fā)展的一個(gè)主要原因，其病理表現(xiàn)以心肌細(xì)胞收縮和（或）舒張功能異常為主，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)在此過程中起著至關(guān)重要的作用。生物體內(nèi)的多種鈣調(diào)控蛋白均對Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有調(diào)控作用，其中，心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA2α）是參與鈣離子調(diào)節(jié)的主要蛋白之一。本研究探討擴(kuò)張型心肌病中SERCA2α和PLB的變化及擴(kuò)心方的干預(yù)作用。

SERCA2α的主要功能是將細(xì)胞液中的Ca2+攝取到肌漿網(wǎng)中，使細(xì)胞液中Ca2+濃度下降，肌漿網(wǎng)中Ca2+儲(chǔ)備升高。若SERCA2α水平降低，肌漿網(wǎng)攝取的Ca2+減少，將直接引起胞漿中Ca2+濃度下降速度減慢，肌漿網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)備降低，進(jìn)而引起兩方面的病理變化:一是降低的Ca2+瞬變峰值會(huì)使Ca2+釋放入胞液的速度和量減少，導(dǎo)致心肌收縮功能障礙；二是鈣攝取的下降使得肌漿網(wǎng)不能快速從胞液中攝回Ca2+，故胞質(zhì)中的Ca2+含量較高，心肌無法充分舒張，導(dǎo)致心肌舒張功能障礙。Jiang Y等[7]的實(shí)驗(yàn)研究證明，SERCA2α的表達(dá)對心肌的損傷及預(yù)后起著重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠心功能的降低，SERCA2αmRNA、蛋白表達(dá)水平亦顯著下降，與相關(guān)研究的發(fā)現(xiàn)類似[8,9]。

PLB是調(diào)節(jié) SERCA2α活性的一個(gè)重要蛋白。Tsuji T等[10]研究顯示，PLB的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致SERCA2α活性顯著降低。PLB對SERCA2α的抑制作用，會(huì)導(dǎo)致肌漿網(wǎng)攝取Ca2+減少，胞漿Ca2+濃度下降速度減慢，肌漿網(wǎng)Ca2+貯存降低，從而使DCM大鼠心臟功能進(jìn)一步減弱。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得出相同的結(jié)果，DCM大鼠的PLB mRNA及蛋白水平顯著升高。因此，我們可以通過改善心肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性，如提高SERCA2a的表達(dá)，降低PLB的表達(dá)，來改善DCM的心功能及臨床癥狀，減少心肌損傷。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，擴(kuò)心方干預(yù)治療4周后，DCM大鼠的EF、FS值明顯提高，心肌病理形態(tài)改善明顯，提示擴(kuò)心方可有效改善DCM大鼠的心功能及心肌損傷，同時(shí)，心肌SERCA2αmRNA及蛋白表達(dá)升高，PLB mRNA及蛋白表達(dá)降低，提示擴(kuò)心方改善DCM的機(jī)制可能與提高心肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控相關(guān)蛋白SERCA2α的表達(dá)、降低PLB的表達(dá)有關(guān)。一方面，擴(kuò)心方通過提高DCM大鼠心肌SERCA2α的表達(dá)，改善肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝取與儲(chǔ)存功能，從而改善心肌細(xì)胞的舒縮功能；另一方面，擴(kuò)心方通過抑制DCM大鼠心肌PLB的表達(dá)，緩解PLB對SERCA2α的抑制作用，間接提高肌漿網(wǎng)鈣泵的攝鈣能力，從而改善心肌細(xì)胞舒縮功能。

通過以上研究，我們認(rèn)為擴(kuò)心方可通過糾正SERCA2α、PLB mRNA和蛋白表達(dá)的異常，改善心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布和運(yùn)轉(zhuǎn)障礙，恢復(fù)Ca2+介導(dǎo)的興奮-收縮偶聯(lián)過程，最終起到改善心功能、減輕心肌損傷的作用。

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