基于DNA條形碼對湖北中藥材市場的調查分析＊

汪 波，周豫新，覃 桂，胡志剛，胡軍林＊＊

（1.湖北省藥品監督檢驗研究院 武漢 430064；2.湖北中醫藥大學藥學院 武漢 430065）

數千年來，中藥以其特有療效與作用，在防治疾病、保健康復方面顯示出獨特優勢和魅力，是當前國際醫藥市場重要組成部分[1]。伴隨自然醫療意識深入人心，中藥以其療效好、毒副作用小等特點，受到全世界消費者的關注[2]，據估算，65%-80%人口自主把健康治療基礎方式選擇在中醫藥上，中藥行業優勢不斷突顯[3]，是國民經濟重要支柱之一。

中藥材的質量是中藥質量的根本，也是保證中醫臨床用藥安全有效的關鍵。近年來，受資源緊缺、市場需求膨脹、從業人員質量意識薄弱、監管不到位等多種因素影響[4]，中藥材質量堪憂，以假充真，誤用混用等現象屢禁不止，如以木防己、漢防己冒充防己，滇棗仁冒充酸棗仁，伊貝母充當川貝母，據對全國四萬余批中藥材及飲片調查發現其合格率僅63.93%，逾50種中藥材摻偽率在50%以上，其中海風藤摻偽率達95%，大青葉摻偽率達94%，川貝母摻偽率達68%，半夏摻偽率62%[5]，中藥材摻偽嚴重影響中藥質量安全，調查發現近50%青蒿琥酯片為假藥[6]，60%的紅景天存在摻偽[7]，中藥材摻偽已然成為危害公眾健康的毒瘤，阻礙中藥材產業和中醫藥事業健康發展[8]。

作為神農故里，時珍故鄉，湖北省中醫藥歷史悠久，資源豐富，道地藥材品目繁多，是我國重要的藥材主產區之一[9]，嚴格把控湖北省中藥材質量對大健康產業發展具有不可忽視的促進作用。然而，當前藥典規定的中藥材性狀特征多依野生資源制定，大量流通的栽培品與野生品間的性狀差異給中藥材真偽鑒定造成很大障礙，且近源種的化學成分相似，以其為標記物的鑒別手段力所不及[10]，給中藥材質量監管提出一定挑戰。

DNA條形碼是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA片段實現物種鑒定的分子診斷新技術[11]，通過比較物種中的標準鑒定片段，對物種進行快速準確識別和鑒定。陳士林等通過分析753屬4 800種6 600余份藥用植物樣本，提出以ITS2為主，葉綠體psbA-trnH為輔的植物類中藥材鑒定體系[12]，并建立了信息量最為豐富的藥材DNA條形碼鑒定數據庫，涵蓋23,262種藥用植物的78,847條序列（http://www.tcmbarcode.cn/china/）[13]，該鑒定體系已被中國藥典2015年版收錄。本研究旨在利用DNA條形碼鑒定技術對湖北省市場流通中藥材進行調查分析，探討湖北省中藥材摻偽情況，為中藥材質量監管提供數據基礎及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料均為湖北市場流通中藥材抽樣，根及根莖類藥材365份，皮類及莖木類藥材35份，葉類及全草類藥材3份，果實及種子類藥材79份，動物類藥材12份，其它類藥材（如海金沙、蒲黃等）12份，共計中藥材樣品506份，隸屬59個物種，涵蓋動物、植物及真菌，涉及中藥材相關企業及醫療機構89家。中藥材DNA條形碼識別系統由中國中醫科學院中藥研究所陳士林教授提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

對所收集的植物藥材用75%乙醇擦拭表面后，刮掉外表面，取干燥組織約30 mg，用高通量組織研磨儀（Scientz-48，China）研磨120 s（50 Hz）至呈粉末狀，使用植物DNA提取試劑盒（TIANGEN Biotech(Beijing)Co.,Ltd DP305-02）提取總DNA，稍作改進如：56℃水浴過夜，使用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提2次，加入-20℃預冷的異丙醇沉淀DNA。動物藥材用75%乙醇清潔表面后，取組織約30 mg，剪碎后使用核分離緩沖液（200 mM Tris-HCl，50 mM EDTA，250 mM NaCl，2%PVP-40，pH 8.0）洗滌樣品兩次，按照動物基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，SK8222）標準操作流程提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增

PCR擴增引物、反應體系及擴增程序等參考中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則（《中華人民共和國藥典》2015年版通則9107），PCR擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對條帶單一且清晰的PCR產物純化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.,USA）測序儀進行雙向測序。

1.2.3 數據處理

將測序所得峰圖使用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.,USA）校對拼接，去除引物區及低質量區，從而獲得植物類中藥材ITS2鑒定序列及動物類中藥材COI鑒定序列，采用MEGA6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）對所獲序列進行比對分析。據中藥材DNA條形碼識別系統操作流程，與標準數據庫進行比對，比對算法采用Blast1，E值（E-value）設為1e-5[14]，確定樣品拉丁名后，與2015年版中國藥典規定的基原物種比對判別藥材真偽。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增成功率

從收集的506份樣品中，成功獲得動物類藥材鑒定序列COI 12條，植物類藥材鑒定序列ITS2 482條，共計494份樣品獲得高質量鑒定序列，總體來看，PCR擴增成功率占總抽樣的98%。果實及種子類藥材、皮類及莖木類藥材、葉類及全草類藥材和動物類藥材的擴增成功率均為100%；根及根莖類擴增成功率次之為98%，紅參、天麻等品種未得到有效擴增；其它類藥材擴增成功率75%，如乳香、沒藥等品種未能檢測到擴增條帶（圖1）。

圖1 抽取樣品DNA條形碼鑒定統計分析結果

2.2 鑒定成功率

在獲得的494條序列中，經比對可確定物種的序列477條，鑒定成功率為97%。如圖1所示果實及種子類藥材、葉類及全草類藥材和動物類藥材均能準確鑒定到種，約1%（4/365）的根及根莖類藥材（粉葛）、37%（13/35）的皮類及莖木類藥材（黃柏）僅能鑒定到屬。

2.3 中藥材摻偽情況分析

經過與DNA條形碼標準數據庫比對，共鑒定出偽品28份，占所抽查樣品的5.5%。根及根莖類藥材偽品比例為6%，其中川貝母摻偽率20%，法半夏17%，黃芩5%；果實及種子類藥材摻偽率6.3%，青葙子及桃仁分別存在50%和44%的摻偽；皂角刺摻偽率9%，占皮類及莖木類藥材的2.9%（圖2）；葉類及全草類和動物類藥材經鑒定均為正品。

圖2 中藥材偽品鑒定結果統計圖

據《中華人民共和國藥典》2015年版規定川貝母基原川貝母（Fritillaria cirrhosa）、暗紫貝母（F.unibracteata）、甘肅貝母（F.przewalskii）、梭砂貝母（F.delavayi）、太白貝母（F.taipaiensis）或瓦布貝母（F.wabuensis），法半夏基原半夏（Pinellia ternata），黃芩基原黃芩（Scutellaria baicalensis），青葙子基原青葙（Celosia argentea），桃仁基原桃（Prunus persica）或山桃（P.davidiana），皂角刺基原皂莢（Gleditsiasinensis）。

3 討論

3.1 DNA條形碼鑒定技術在中藥材質量控制中的優勢

DNA條形碼鑒定法較傳統鑒定方法，技術簡便，易于操作；鑒定準確，具有獨一無二的可重復性；使用方便，采用標準操作流程可批量完成鑒定工作[15]。本研究按照《中華人民共和國藥典》2015年版提供的標準操作流程，在兩周時間內完成了506份中藥材鑒定工作，成功獲得494份樣品的DNA條形碼序列，準確鑒定477份樣品，鑒定成功率達97%。針對多基原藥材及種子類藥材的鑒定更是展現出獨特優勢，如川貝母基原為六種同屬植物，各基原物種間及栽培品與野生品間的性狀差異較小，使得形態鑒定困難，摻偽嚴重，本研究中有20%的川貝母樣品經DNA條形碼鑒定為伊貝母；種子類藥材形狀小，性狀特征相似，真偽更是難辨，經DNA序列比對，發現44%的桃仁樣品為苦杏仁，青葙子實為綠穗莧種子（圖2）。DNA條形碼鑒定技術在對中藥材質量控制方面具有顯著的優越性。

3.2 PCR擴增失敗原因分析

3.2.1 中藥炮制品

中藥材在加工處理過程中，常會采用繁瑣炮制手段[16]，如紅參炮制工藝蒸制3h，70℃烘10 h；天麻105℃蒸制20min，切薄片，(70±2)℃干燥4 h。經長時間高溫處理會導致DNA嚴重降解影響PCR擴增效率，在本研究中收集了紅參樣品1份，天麻7份，均擴增失敗，此類樣品的鑒定方法仍有待優化，如采用磁珠法[17]等提高DNA提取效率，或采用小片段DNA條形碼序列[18]等提高PCR擴增效率。

3.2.2 樹脂類藥材

樹脂類藥材源自植物分泌物或滲出物，如源自松科的松香，棕櫚科的血竭，橄欖科的乳香和沒藥都是常見的樹脂類藥材，這類藥材DNA含量極低，降解也是極為嚴重，本研究收集的樹脂類藥材也均擴增失敗，樹脂類藥材分子鑒定仍是DNA條形碼鑒定難點。作者曾以長度100 bp的trnL內含子P6環序列為DNA條形碼成功鑒定了樹脂類藥材血竭及其混偽品龍血竭[19]，小片段DNA序列在樹脂類藥材鑒定中極具潛力，但由于片段過小，變異位點有限，仍需擴大樣本評估鑒定效率。

3.3 物種鑒定失敗原因分析

盡管以ITS2為主psbA-trnH為輔的DNA條形碼體系對絕大部分中藥材具有很好的鑒定效率，但由于其片段長度限制，對部分近源種的鑒定仍有局限性，如黃柏與關黃柏，分別為黃皮樹（Phellodendronchinense）和黃檗（P.amurense）的干燥樹皮，與本研究結果一樣，現有條形碼序列并不能對其進行區分[20]。葛根和粉葛分別來源于野葛（Pueraria lobata）和甘葛藤（P.thomsonii），現版藥典將其分列為兩個品種，但據中國植物志記載甘葛藤為野葛變種，屬種下關系，而中藥材DNA條形碼鑒定體系僅針對種水平的鑒定，葛根和粉葛的DNA序列相似度極高。對于現有DNA條形碼鑒定能力較差的物種，將考慮重新篩選適宜鑒定序列[21]或采用單核苷酸多態性（SNP）檢測[22]。

4 展望

DNA作為遺傳信息載體，具極高遺傳穩定性，不受發育階段、外部環境、組織差異影響，鑒定結果具高度重復性和穩定性，可用于中藥材標準化真偽鑒定[23]，是中藥材監管有效手段。不斷完善近源種及特殊炮制藥材DNA條形碼鑒定方法，針對摻偽嚴重品種建立快速檢測體系，與其它中藥檢測技術手段不斷融合，必將對中藥產業現代化、標準化起到巨大推動作用。

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