基于含水量和單雙酯型生物堿含量探究栽培和野生附子去皮的差異＊

劉 鵬，孫美玲，張 荳，彭詩濤，張先靈，李 飛，胡慧華

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

附子為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx子根的加工品，其味辛、甘，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛之功效[1]。關(guān)于附子去皮的炮制方法，漢代《金匱玉函經(jīng)》[2]有言“去黑皮，刀刲取里白者”；東晉《肘后備急方》記載：“《經(jīng)驗(yàn)后方》治白虎風(fēng)，……，附子（炮裂，去皮臍）各一兩……”[3]；雷斅[4]提到：“附子若陰制者，生去皮尖底，薄切……”；宋代《證類本草》[5]有言“用刀刮上孕子并去底尖”。另外，明代李時(shí)珍在《本草綱目》中也有相應(yīng)記載，“附子生用者，須如陰制之法，去皮臍入藥”[6]；《普濟(jì)方》中也有關(guān)于“去皮”的記載[7]。

張仲景最早廣泛使用附子，在其《傷寒論》[8]中使用附子有20首，《金匱要略》[9]中有13首。張仲景記載的附子的炮制方法有“炮，去皮，破八片”、“生用，去皮，破八片”，并強(qiáng)調(diào)附子無論炮制與否都要去皮。宋代由國家校正醫(yī)書局的高保衡、孫奇、林億編寫的《傷寒論》序中談及：“張仲景，南陽人，名機(jī)，仲景乃其字也。舉孝廉，官至長沙太守。始受術(shù)于同郡張伯祖，時(shí)人言，識(shí)用精微過其師”。據(jù)考證，張仲景生活的年代大約為公元150-219年，具體出生地點(diǎn)在今河南省南陽市鄧州市穰東鎮(zhèn)張寨村，其使用的附子可能為南陽附近的野生附子。現(xiàn)在，我們使用的附子大多來自栽培品種，其中江油附子是道地產(chǎn)區(qū)，因此本實(shí)驗(yàn)采集江油附子作為栽培品與南陽野生附子對照。2015版《中國藥典》有黑順片、白附片、淡附片、炮附片等炮制品。其中，只有白附片這一種炮制品去皮。有關(guān)研究表明，附子炮制后其毒性降低可能與其雙酯型生物堿轉(zhuǎn)換為單酯型生物堿有關(guān)，但由于雙酯型生物堿既是其毒性成分，又是其有效成分。因此，2015版《中國藥典》以單、雙酯型生物堿含量為標(biāo)準(zhǔn)共同控制附子的毒性。通過實(shí)地采集和比較發(fā)現(xiàn)，江油地區(qū)一枚中等大小的鮮附子重量約為30 g，南陽地區(qū)的一枚新鮮附子重量約為7 g，兩者的重量存在較大的差異，因此本實(shí)驗(yàn)通過采集張仲景出生地南陽的附子和現(xiàn)在使用的江油附子，比較附子去皮前后單雙酯型生物堿含量和含水量的變化，進(jìn)一步為臨床炮制附子是否去皮提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（DAD檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-3型循環(huán)多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑

新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110799-201106、110720-201111、110798-201106、111795-201102、111796-201002、111794-201303）；乙腈、四氫呋喃（德國Merck公司，色譜純)，其余試劑均為分析純；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 藥物

江油附子藥材，2016年6月購于四川江油；南陽附子，2016年10月采挖于河南南陽。經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]

采用藥典法，以乙腈-四氫呋喃（25∶15）為流動(dòng)相A，以0.1mol·L-1醋酸銨（每1 L含冰醋酸0.5 mL）為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1；檢測波長235 nm。流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取新烏頭堿對照品0.0 5mg、烏頭堿對照品0.05 mg、次烏頭堿對照品0.05 mg、苯甲酰新烏頭原堿0.10 mg、苯甲酰次烏頭原堿0.10 mg、苯甲酰烏頭原堿0.10 mg混合，置于10 mL量瓶中，加入異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液定容，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取附子及其皮適量，粉碎，過三號(hào)篩，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氨試液3 mL，再精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz，水溫在25℃以下）30 min，放至室溫，再稱定重量，加異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下回收溶劑至干，精密加入異丙醇-二氯甲烷（1∶1）3 mL溶解殘?jiān)苓^0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試液[1]。

表2 附子中6種生物堿對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 樣品檢測

精密量取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄保留時(shí)間和峰面積，根據(jù)2.7項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）計(jì)算各供試品溶液中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿的含量。檢測2個(gè)產(chǎn)地附子皮、去皮附子及帶皮附子中6種生物堿含量。

2.5 附子去皮前后含水量的檢測

從江油泥附子中隨機(jī)稱取3批，每批約400 g，去皮，將去皮后的附子切片，將不同批次皮與附片分開干燥；干燥前后分別稱重。

從南陽泥附子中隨機(jī)稱取3批，每批約500 g，去皮，將去皮后的附子切片，將不同批次皮與附片分開干燥；干燥前后分別稱重。

2.6 統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.30獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取2.2項(xiàng)下的混合溶液2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mL定容到10 mL容量瓶中制成不同濃度的對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，裝入液相小瓶中。精密量取各濃度溶液10μL注入高效液相中，結(jié)果如表2。

表3 江油、南陽附子去皮前后含水量差異（n=3）

表4 江油、南陽附子去皮前后單、雙酯型生物堿含量/%

3 結(jié)果與分析

通過表3的對比發(fā)現(xiàn)，江油附子皮含水量顯著高于南陽附子皮的含水量（t=6.74，P=0.018 9）。對比江油和南陽附子去皮之后附子含水量，南陽附子去皮后含水量顯著高于江油去皮附子的含水量（t=-10.81，P=0.000 4）。對比江油和南陽附子干皮占整個(gè)干附子的重量比例，南陽附子干皮占整個(gè)附子的比重顯著高于江油附子干皮占整個(gè)附子的比重（t=-13.04，P=0.000 2）。

通過對比江油附子去皮前后的含水量發(fā)現(xiàn)，去皮前含水量顯著高于去皮之后（t=4.89,P=0.009 4），對比南陽附子去皮前后的含水量發(fā)現(xiàn)，去皮前含水量顯著低于去皮之后（t=-4.13,P=0.014 5）。

分析對比結(jié)果，江油附子皮含水量高，因此去皮后使整個(gè)附子含水量降低，南陽附子皮含水量低，附子干皮占整個(gè)附子比重高，因此去皮后含水量更高。

通過表4對比南陽和江油的附子去皮前后單雙酯型生物堿含量發(fā)現(xiàn)，南陽附子皮中單酯型生物堿含量顯著高于江油附子（t=-58.03，P＜0.000 1），雙酯型生物堿含量也顯著高于江油附子（t=-1 513.7，P＜0.000 1）。南陽附子去皮后單酯型生物堿含量也高于江油附子（t=-9.94，P=0.000 6），雙酯型生物堿含量顯著也高于江油附子（t=-40.49，P=0.000 6）。南陽附子去皮前單酯型生物堿含量和江油附子無顯著差異（t=-2.50，P=0.129 8），雙酯型生物堿含量顯著高于江油附子（t=-10.93，P=0.008 3）。

通過對比江油附子去皮前后單雙酯型生物堿含量發(fā)現(xiàn)，江油附子去皮前單酯型生物堿含量和去皮后單酯型生物堿含量無顯著差異（t=2.74，P=0.071 3），江油附子去皮前雙酯型生物堿含量顯著高于去皮后雙酯型生物堿含量（t=11.75，P=0.001 3），南陽附子去皮前單酯型生物堿含量和去皮后單酯型生物堿含量無顯著差異（t=-1.29，P=0.150 8），南陽附子去皮前雙酯型生物堿含量顯著低于去皮后雙酯型生物堿含量（t=-3.71，P＜0.0341）。

分析對比結(jié)果可知，江油附子皮中含有較低的雙酯型生物堿，含水量高，生物堿易溶出，因此去皮能夠顯著降低雙酯型生物堿含量。南陽附子皮中含有較高的雙酯型生物堿，去皮能夠顯著增加雙酯型含量，可能與皮占干附子重量比例大且含水量低，因此去皮前不易溶出，去皮后反而使雙酯型生物堿易溶出有關(guān)。

4 總結(jié)與討論

藥典規(guī)定，單酯型生物堿含量是苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿三者含量的總和；雙酯型生物堿含量是新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿三者的總和。本研究通過對比江油附子和南陽附子去皮前后含水量和單雙酯型生物堿含量，探討南陽和江油附子去皮的差異。結(jié)果顯示，江油附子皮含水量高，去皮后其雙酯型生物堿顯著降低，但是依舊高于藥典要求的雙酯型生物堿總量（0.02%），且附子皮占附子重量比例低，去皮耗費(fèi)人工和時(shí)間，因此可以考慮不去皮，現(xiàn)在附子的炮制品種也大多未去皮；南陽附子皮含水量低，且占總附子重量比例大，南陽附子雙酯型生物堿含量高且去皮后使雙酯型生物堿容易溶出，有利于生物堿發(fā)揮作用，因此，南陽附子去皮可以有效降低毒性，這可能是張仲景去皮的原因。由于張仲景生附子也在方劑中使用，因此其去皮具有一定的合理性，但現(xiàn)在臨床使用附子大多使用栽培品的炮制品，所以生附子是否去皮還需要進(jìn)一步的研究。

1 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:191-193.

2 中醫(yī)研究院中藥研究所.歷代中藥炮制資料輯要.北京:中醫(yī)研究院中藥研究所,1973:1.

3 葛洪.肘后備急方.北京:天津科學(xué)技術(shù)出版社,2005:74.

4錢超塵,董連榮.《本草綱目》詳譯.太原:山西科學(xué)技術(shù)出版社,1999:921.

5 唐慎微.重修政和經(jīng)史證類備用本草.北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:244.

6 李時(shí)珍.本草綱目.南京:江蘇人民出版社,2006:264.

7 朱棣.普濟(jì)方.北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:123.

8 張機(jī).傷寒論.上海:上海人民出版社,1976.

9 張仲景.金匱要略.北京:人民衛(wèi)生出版社,1997.