微小RNA-134-5p靶向作用于EGFR對卵巢癌SKOV3和A2780細胞生長的影響

湯繼英，陳 萍，蔡曉軍，汪選斌，曹風軍，張 莉

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院：1.腫瘤中心；2.中藥藥理實驗室，湖北十堰 442000)

表皮生長因子受體(EGFR)信號通路的活化可促進腫瘤細胞周期進展，抑制細胞的凋亡，增強細胞的增殖能力，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1-3]。有研究表明，miR-134-5p在肺癌中可顯著干擾EGFR基因的表達[4]。然而miR-134-5p在卵巢癌細胞中對EGFR信號通路的影響尚未闡明。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-134-5p，觀察卵巢癌細胞中EGFR信號通路的表達情況及卵巢癌細胞生物學行為的變化。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢癌細胞系SKOV3和A2780(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；miR-134-5p模擬物(mimics)，miR-NC(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；qRT-PCR相關(guān)試劑(日本TaKaRa公司)；引物(上海生物工程股份有限公司，表1)；本實驗所用抗體均購自美國CST公司；四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Sigma公司)；Annexin V-FICT/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 卵巢癌細胞系SKOV3和A2780貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為：37 ℃，5%CO2，飽和濕度。對照組轉(zhuǎn)染miR-NC，實驗組轉(zhuǎn)染miR-134-5p mimics，具體操作步驟參考lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書。

1.2.2qRT-PCR檢測 收集細胞，依據(jù)TaKaRa試劑盒說明書建立反應體系及參數(shù)，以GAPDH為內(nèi)參，進行qRT-PCR，檢測兩組細胞中EGFR基因的表達，最終Ct值均以2-ΔΔCt分析。

1.2.3Western blot檢測miR-143下游靶基因表達 轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞進行細胞裂解提取總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，分別孵育一抗、二抗，發(fā)光劑顯影。

1.2.4細胞周期實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰酶消化收集細胞；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，棄上清液，加入70%乙醇在4 ℃下固定12 h；離心收集細胞，PBS洗2次，加入含RNA酶的PI染液400 μL避光染色1 h，流式細胞儀上機檢測。

1.2.5細胞凋亡實驗 轉(zhuǎn)染實驗后48 h，使用胰酶消化收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測。

1.2.6MTT法檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染24 h后的細胞按4 000/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板，分別于第1、2、3、4、5天，每孔加MTT 20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液。每孔加二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標儀波長490 nm處測定光密度(OD)值。

1.2.7集落形成實驗 瞬轉(zhuǎn)后24 h，胰酶消化收集細胞，并計數(shù)。6孔板中加入細胞1 000 /孔，搖晃均勻，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)10 d左右。10 d后觀察集落形成情況，并使用結(jié)晶紫染色法固定染色細胞，拍照、分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-134-5p與EGFR mRNA結(jié)合位點 miR-134-5p結(jié)合于EGFR mRNA的3′UTR(圖1)，mirSVR評分為-1.0627， PhastCons評分為0.5561。

圖1 miR-134-5p與EGFR mRNA3′UTR結(jié)合位點

2.2miR-134-5p轉(zhuǎn)染效率檢測 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中miR-134-5p的表達明顯上升(P<0.01)，見圖2。

a：P<0.01，與對照組比較

2.3各組細胞中EGFR基因mRNA及蛋白表達 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組SKOV3細胞中EGFR mRNA下調(diào)至48%(P<0.05)，A2780細胞中EGFR mRNA下調(diào)至47%(P<0.05)(圖3)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中EGFR蛋白表達降低(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較

2.4EGFR下游靶蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-134-5p后的卵巢癌細胞中，EGFR信號通路中的磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK1/2)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blot 檢測兩組卵巢癌細胞中蛋白的表達

2.5卵巢癌細胞周期和細胞凋亡 流式細胞術(shù)檢測顯示，與對照組相比，實驗組中G0/G1期細胞明顯增多，G2/M期細胞明顯減少，A2780細胞S期細胞明顯減少(P<0.05)，而SKOV3細胞S期細胞比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。實驗組較對照組凋亡明顯增多，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表2 兩組卵巢癌細胞的細胞周期結(jié)果比較

表3 兩組卵巢癌細胞的凋亡率、集落形成能力結(jié)果比較

2.6轉(zhuǎn)染miR-134-5p后細胞增殖能力 MTT結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組SKOV3細胞在第4、5天細胞生長明顯受到抑制，A2780細胞在第5天的生長抑制有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

*：P<0.05，與對照組比較

2.7轉(zhuǎn)染miR-134-5p后細胞集落形成能力 與對照組相比，實驗組的集落少而小，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3，集落形成見圖6。

圖6 兩組卵巢癌細胞形成的集落圖

3 討 論

EGFR屬于l型酪氨酸激酶ErbB家族，是一種重要的跨膜受體[5-6]。EGFR可介導細胞的增殖、分化及凋亡，且EGFR的過表達或異?；罨c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。p-EGFR是EGFR的活性形式，p-EGFR可通過激活下游靶蛋白p-AKT、p-ERK1/2和Cyclin D1的表達，促進腫瘤細胞的增殖、抑制腫瘤細胞的凋亡[8]。RNA干擾是指內(nèi)源性miRNA或外源性dsRNA通過與細胞內(nèi)的酶如解旋酶、內(nèi)切酶、外切酶等結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)。RISC在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因mRNA結(jié)合，特異性切割降解mRNA，從而達到干擾靶基因表達的作用[9]。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼 RNA分子，長度為19～25個核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，參與細胞的增殖、分化、衰老、凋亡等多種功能變化，與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。miR-134-5p在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制多種腫瘤如結(jié)食道癌、肝癌、腎癌、乳腺癌等細胞的增殖能力或遷移、侵襲能力[11-13]。有研究表明，肺癌細胞中miR-134-5p可干擾EGFR基因的表達[4]；那么miR-134-5p在卵巢癌中是否同樣能夠干擾EGFR通路的活化，有待進一步研究。

本研究通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-134-5p后，卵巢癌細胞中EGFG、pEGFR及下游靶蛋白p-AKT、p-ERK1/2和Cyclin D1的表達明顯下調(diào)。p-AKT和p-ERK1/2異常高表達與腫瘤的形成密切相關(guān)[14]。Cyclin D1是細胞增殖周期中的啟動因子，通過與CDK4或CDK6結(jié)合形成復合物，促進細胞越過G1調(diào)控點[15]。本課題組下一步將構(gòu)建穩(wěn)定表達miR-134-5p的病毒載體，通過裸鼠荷瘤實驗觀察miR-134-5p在體內(nèi)對卵巢癌生長的影響。轉(zhuǎn)錄激活因子-5b(STAT5b)是信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子的一種，STAT5b的持續(xù)或高表達與多種惡性腫瘤的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)[16]。有研究表明，STAT5b在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達[17]。本研究通過miRNA靶基因預測網(wǎng)站microRNA.org、TargetScan和miRecords發(fā)現(xiàn)STAT5b是miR-134-5p的靶基因，miR-134-5p是否能通過靶向作用于STAT5b發(fā)揮抑癌作用值得研究。

本研究表明，miR-134-5p可通過靶向作用于EGFR基因的表達，沉默EGFR信號通路的活化，顯著抑制卵巢癌細胞的增殖。miR-134-5p干擾EGFR基因表達的機制研究在未來可能為卵巢癌及其他相關(guān)疾病提供一個新型的治療手段。

[1]MOHYELDIN M M,AKL M R,SIDDIQUE A B,et al.The marine-derived pachycladin diterpenoids as novel inhibitors of wild-type and mutant EGFR[J].Biochem Pharmacol,2017(126):51-68.

[2]MARTINELLI E,MORGILLO F,TROIANI T,et al.Cancer resistance to therapies against the EGFR-RAS-RAF pathway:the role of MEK[J].Cancer Treat Rev,2017(53):61-69.

[3]YANG Q S,JIANG L P,HE C Y,et al.Up-regulation of microRNA-133a inhibits the MEK/ERK signaling pathway to promote cell apoptosis and enhance radio-sensitivity by targeting EGFR in esophageal cancer in vivo and in vitro[J].J Cell Biochem,2017,118(9):2625-2634.

[4]QIN Q,WEI F R,ZHANG J B,et al.miR-134 inhibits non-small cell lung cancer growth by targeting the epidermal growth factor receptor[J].J Cell Mol Med,2016,20(10):1974-1983.

[5]TSIAMBAS E,LEFAS A Y,GEORGIANNOS S N,et al.EGFR gene deregulation mechanisms in lung adenocarcinoma:a molecular review[J].Pathol Res Pract,2016,212(8):672-677.

[6]SINGH D,ATTRI B K,GILL R K,et al.Review on EGFR inhibitors:critical updates[J].Mini Rev Med Chem,2016,16(14):1134-1166.

[7]MENG F,WANG F,WANG L,et al.MiR-30a-5p overexpression may overcome EGFR-inhibitor resistance through regulating PI3K/AKT signaling pathway in non-small cell lung cancer cell lines[J].Front Genet,2016(7):197.

[8]JEDLINSKI A,GARVIN S,JOHANSSON A C,et al.Cetuximab sensitivity of head and neck squamous cell carcinoma xenografts is associated with treatment-induced reduction in EGFR,pEGFR,and pSrc[J].J Oral Pathol Med,2017,46(9):717-724.

[9]SVOBODA P.Renaissance of mammalian endogenous RNAi[J].FEBS Lett,2014,588(15):2550-2556.

[10]LOGAN M,HAWKINS S M.Role of microRNAs in cancers of the female reproductive tract:insights from recent clinical and experimental discovery studies[J].Clin Sci (Lond),2015,128(3):153-180.

[11]KLIMCZAK-BITNER A A,KORDEK R,BITNER J,et al.Expression of MMP9,SERPINE1 and miR-134 as prognostic factors in esophageal cancer[J].Oncol Lett,2016,12(5):4133-4138.

[12]ZHA R,GUO W,ZHANG Z,et al.Genome-wide screening identified that miR-134 acts as a metastasis suppressor by targeting integrin β1 in hepatocellular carcinoma[J].PLoS One,2014,9(2):e87665.

[13]LIU Y,ZHANG M,QIAN J,et al.miR-134 functions as a tumor suppressor in cell proliferation and epithelial-to-mesenchymal transition by targeting KRAS in renal cell carcinoma cells[J].DNA Cell Biol,2015,34(6):429-436.

[14]LIU H,MOROI Y,YASUMOTO S,et al.Expression of insulin-like growth factor-1 receptor,p-AKT and p-ERK1/2 protein in extramammary Paget′s disease[J].Br J Dermatol,2006,155(3):586-591.

[15]GIOACCHINI F M,ALICANDRI-CIUFELLI M,KALECI S,et al.The prognostic value of cyclin D1 expression in head and neck squamous cell carcinoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2016,273(4):801-809.

[16]SUMIYOSHI H,MATSUSHITA A,NAKAMURA Y,et al.Suppression of STAT5b in pancreatic cancer cells leads to attenuated gemcitabine chemoresistance,adhesion and invasion[J].Oncol Rep,2016,35(6):3216-3226.

[17]JINAWATH N,VASOONTARA C,JINAWATH A,et al.Oncoproteomic analysis reveals co-upregulation of RELA and STAT5 in carboplatin resistant ovarian carcinoma[J].PLoS One,2010,5(6):e11198.