抗人FXYD6特異性多肽單克隆功能性抗體制備及生物學作用鑒定

陳雄飛，袁俊建，張執全，郭忠健，郭 堯，劉汝海，李鳳山

(河北省滄州市中心醫院：1.普外一科；2.病理科；3.中心實驗室 061001)

包含轉運調節因子(FXYD)結構域的FXYD6蛋白作為FXYD家族蛋白成員之一，為Ⅰ型跨膜蛋白，通過調節鈉、鉀泵的活性發揮部分生物學功能[1]，其在神經元中高表達，利于突觸體信號轉導[2]，在維持神經元正常形態和功能方面發揮了重要作用[3]，且FXYD6與精神分裂癥相關[4]。同時，FXYD6作為一種腫瘤相關蛋白，在膽管癌[5-6]、肝癌[7]、鼻咽癌[8]等惡性腫瘤中高表達，可促進人骨肉瘤細胞增殖與侵襲[9]。為研究FXYD6蛋白的組織學分布和生物學作用，并為相關腫瘤的靶向治療奠定實驗基礎，本課題組現制備抗人FXYD6特異性多肽單克隆功能性抗體庫，并對其胞外區單克隆抗體生物學作用進行鑒定。

1 材料與方法

1.1材料 人FXYD6胞內區-G4S-FXYD6胞外區-G4S-GST-His6TAG基因序列的原核表達質粒、BSA-FXYD6胞外區偶聯蛋白(中國華大蛋白基因有限公司合成)；大腸桿菌BL21(中國北京康潤誠業生物技術公司)；Ni Sepharose 6 Fast Flow純化柱(中國GE Healthcare生物科學公司)；SPF級BALB/c小鼠(中國科學院遺傳所動物實驗中心)；SP2/0小鼠骨髓瘤細胞(中國華大基因蛋白生物有限公司)；pcDNA3.1-FXYD6質粒(前期制備)；293T細胞株、HepG2細胞株(ATCC中科院生物物理所凍存)；胎牛血清,1640培養基，次黃嘌呤、甲氨喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)培養基、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)培養基、聚乙二醇(美國Sigma公司)；抗體亞類試劑盒(美國Southern Biotech公司)；鼠抗Myc單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體、鼠單克隆抗體IgG(中國北京中杉金橋生物技術有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(中國武漢博士德生物工程有限公司)；Western blot高靈敏度化學發光檢測試劑盒(中國北京康為世紀生物有限公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗小鼠IgG(H+L，中國上海碧云天生物技術有限公司)；健康人腦顳葉組織、肝癌組織、正常肝組織(滄州市中心醫院病理科留存的石蠟標本)。

1.2方法

1.2.1抗原蛋白的表達 將人FXYD6胞內區-G4S-FXYD6胞外區-G4 S-GST-His6TAG 基因序列的原核表達質粒轉入表達載體BL21(DE3)，BL21菌生長至對數期后，0.5 mmo/L異丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)誘導，為誘導組，同時設未加ITPG的非誘導組，37 ℃培養4 h，離心收菌，制備蛋白樣品，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，脫色后觀察表達蛋白條帶。

1.2.2抗原蛋白純化 離心收集IPTG誘導后的BL21菌，25 mmol/L Tris 150 mmol/L、NaCl的裂解液重懸，冰上超聲破碎，離心，分離制備上清液和沉淀，蛋白制品 SDS-PAGE，考馬斯亮染色，脫色后發現目的蛋白主要集中在上清液中。上清液流經Ni-NTA金屬螯合柱行層析純化，30 mmol/L咪唑磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫雜蛋白，200 mmol/L咪唑PBS洗脫目的蛋白，將目的蛋白超濾換至PBS并濃縮。

1.2.3動物免疫 參照脾內注射方法[10]，選擇6～8周齡的SPF級BALB/c雌性小鼠，脾臟內注射50 μg抗原蛋白，免疫7 d后，小鼠內眥取血，間接酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測小鼠血清抗體效價，初次免疫2周后用抗原蛋白每只30 μg腹腔注射沖擊免疫達到效價要求的小鼠。

1.2.4雜交瘤細胞融合、篩選、鑒定 取加強免疫3 d后的BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤(1∶5)，應用聚乙二醇(PEG)細胞融合法進行融合，HAT培養基篩選融合細胞，有限稀釋法篩選陽性克隆，即用FXYD6重組蛋白及標簽蛋白通過間接ELISA法篩選針對重組FXYD6抗原有免疫反應的雜交瘤細胞株，同時去除對標簽蛋白有免疫反應的雜交瘤細胞株，即得到針對分泌FXYD6胞內區或胞外區單抗的雜交瘤細胞株。抗體亞類測定試劑盒檢測雜交瘤分泌抗體亞型，應用BSA-FXYD6胞外區多肽通過間接ELISA方法在分泌FXYD6胞內區或胞外區特異性強的單克隆抗雜交瘤中篩選針對其分泌胞外區單抗的細胞株，陽性反應的即為分泌胞外區單抗的雜交瘤細胞株，陰性反應的即為分泌胞內區單抗的雜交瘤細胞株。間接ELISA法測定FXYD6單抗的特異性與效價，用于特異性鑒定的非相關抗原包括FXYD1、FXYD2、FXYD3、FXYD4、FXYD5、FXYD7。選取分泌特異性強及效價高的針對胞外區多肽的單克隆雜交瘤行后續實驗。

人腦顳葉組織、肝癌、正常肝組織經甲醛固定、石蠟包埋、4 μm連續切片，常規脫蠟、水化、抗原修復后，在0.3%過氧化氫溶液中避光30 min，5%馬血清封閉1 h后，滴加已篩選出針對胞外區或胞內區的雜交瘤分泌的上清液(1∶3稀釋)，4 ℃過夜，1∶200的生物素標記馬抗小鼠IgG 37 ℃孵育1 h，1∶200的辣根過氧化物標記鏈卵白素37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復染，逐級脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察單抗與組織中FXYD6結合情況。

1.2.5陽性雜交瘤染色體數目分析 取對數生長期雜交瘤細胞，終濃度0.25 μmol/L秋水仙素處理2 h，離心收集細胞，37 ℃低滲KCl溶液處理15 min，加入甲醇、冰醋酸固定液(3∶1)固定4 min，離心，棄去上清液。在細胞沉淀中加入固定液，室溫靜置30 min后離心，棄去上清液。重復該步驟。滴加細胞懸液到4 ℃載玻片上，室溫自然干燥后用10%的Giemsa溶液染色30 min，洗去染液，二甲苯通透、中性樹脂封片，鏡下觀察選擇分散良好和完整的中期分裂象并照相，統計染色體平均數目(計數大于或等于50個細胞染色體/樣品)。

1.2.6FXYD6胞外區單克隆抗體制備 BALB/c小鼠腹腔注射500 μL石蠟油，1周后腹腔注射1 mL PBS洗滌并定量5×105～9×105/mL分泌胞外區單抗的雜交瘤細胞。1周后取腹水，離心，應用蛋白G親合層析法純化抗體，間接ELISA法測抗體效價。

1.2.7FXYD6胞外區單克隆抗體功能性檢測 取對數生長期的293T細胞，以1×105/mL接種24 h后，瞬時轉染質粒pcDNA3.1-FXYD 6∶2 μg質粒pcDNA3.1-FXYD6稀釋于500 μL Opti-MEM中，另一培養皿加500 μL培養基作對照(未轉染組)，混勻后加入2 μL Lipofectamine 2000轉染試劑，輕柔混勻，室溫放置15 min，6 h后更換成DMEM培養基，再培養30 h，制備蛋白樣品，用Myc單抗和胞外區單抗Western blot檢測真核質粒瞬轉后的293T細胞FXYD6的表達。收集已轉染后的293T細胞，0.3%BSA洗滌細胞后加入以PBS稀釋的胞外區單克隆抗體(1∶200 PBS稀釋)，以小鼠IgG作為空白對照，4 ℃孵育45 min，0.3%BSA 洗滌，加入FITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)，4 ℃避光孵育30 min，0.3%BSA 洗滌，細胞重懸于PBS，行流式細胞儀檢測。

取對數生長期高表達FXYD6蛋白的HepG2細胞[8]，以4×103/mL，100 μL接種于96孔板完全培養基中，每孔加入不同濃度的FXYD6胞外區單克隆抗體(終濃度分別為5、10、20 μg/mL)，每組設3個復孔，同時設小鼠單抗IgG同型對照組，繼續培養24 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養5 h，棄上清液，每孔200 μL PBS洗滌，加入100 μL DMSO溶解藍紫色結晶顆粒后測定A490。實驗重復3次。

2 結 果

2.1抗原蛋白誘導表達 經SDS-PAGE、脫色后，誘導組較非誘導組出現明顯的梭形條帶，表達出目的蛋白相對分子質量與預期相符，見圖1。

1、2、3、5:誘導組；4:非誘導組；M:蛋白marker

2.2抗原蛋白的純化 全菌經超聲破碎后，SDS-PAGE檢測目的蛋白主要集中在上清液中(圖2)。因重組蛋白含有His標簽，選用鎳柱純化目的蛋白，在實驗過程中發現目的蛋白與鎳柱結合較弱，較低濃度咪唑就可以將目的蛋白洗脫，確定以30 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白，超濾換PBS后，目的蛋白經SDS-PAGE檢測純度達90%左右，見圖3。

1：上清液；2：沉淀；M：蛋白marker

1:上清液;2:穿透液;3:穿透液;4:200 mmol/L咪唑洗脫液;5:純化的目的蛋白；M:蛋白marker

2.3雜交瘤細胞株的建立及單克隆抗體鑒定 經過1年的反復凍存和復蘇培養，成功篩選出3株穩定分泌效價高、特異性強的FXYD6單克隆抗體的雜交瘤，這3株陽性雜交瘤行Giemsa染色，鏡下觀察均有106條染色體，為脾淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞染色體數量之和。2株雜交瘤細胞分泌針對胞內區的單克隆抗體，抗體亞型分別為IgG2a、IgG2b，輕鏈均為k鏈；1株雜交瘤細胞分泌針對胞外區的單克隆抗體，抗體亞型為IgG1，輕鏈為λ鏈。制備的3株雜交瘤的上清液均可以識別腦組織中的神經元細胞，神經元彌漫著色，細胞核未見著色，而膠質細胞未見明顯著色(圖4A)，肝癌組織較正常肝組織高表達FXYD6蛋白，見圖4B、C。

A.FXYD6蛋白在神經元細胞中表達(×400)； B.FXYD6蛋白在肝癌細胞中高表達(×400)；C.FXYD6蛋白在正常肝細胞中不表達(×100)

2.4FXYD6胞外區單抗功能性檢測 流式細胞實驗發現FXYD6胞外區單克隆抗體可以特異性識別真核表達載體pcDNA3.1-FXYD6瞬轉293T細胞表達的天然構象人FXYD6蛋白(圖5)，真核表達質粒瞬轉293T細胞后表達的人FXYD6蛋白位于14×103～20×103。FXYD6胞外區單克隆抗體可以抑制肝癌HepG2細胞增殖，中濃度(10 μg/mL)單抗較低濃度(5 μg/mL)單抗對腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用，比較差異有統計學意義(P<0.05)，有一定的濃度依賴性，然而高濃度(20 μg/mL)單抗較中濃度(10 μg/mL)單抗抑制細胞增殖不明顯(圖6)。新制備的FXYD6胞外區單抗為功能阻斷性抗體。

A:FCM檢測；B:Western blot檢測。1:未轉染組;2、3:轉染組;2:Myc單抗；3:FXYD6胞外區單抗

圖6 FXYD6胞外區單克隆抗體抑制HepG2細胞增殖

3 討 論

FXYD家族蛋白是跨膜蛋白，因其胞外近跨膜區含較固定的PFXYD氨基酸序列而得名[11]。通過調節不同鈉鉀泵同工酶發揮部分功能，而FXYD2本身就是Na,K-ATPase γ亞基[12]。部分成員還是腫瘤相關蛋白，與某些腫瘤的發生、發展相關。FXYD3在多種腫瘤中高表達，與直腸癌放療抵抗、局部復發相關，是直腸癌患者預后較差的指標[13]。FXYD5是表達于多種癌細胞和少量正常細胞表面的糖化膜蛋白，通過下調E-鈣黏素促進腫瘤細胞侵襲、轉移，其高表達與不良預后密切相關[14]。FXYD6蛋白沒有糖基化及磷酸化[11]。本研究通過原核表達制備有效的抗原片段來制備識別天然構象抗原的單克隆抗體，在對抗原設計時去除蛋白功能區中的跨膜序列；胞內區、胞外區氨基酸序例串聯與GST融合表達，不僅有助于抗原蛋白的正確折疊，將FXYD6胞外區和胞內區序列完全暴露于融合蛋白表面，提高抗原的免疫原性，同時也提高目的蛋白可融性，便于后續蛋白純化。

大腸桿菌BL21表達出的目的蛋白穩定性高，不易被降解。本實驗中構建的人FXYD6胞內區-G4S-FXYD6胞外區-G4S-GST-His6TAG基因序列表達載體轉入宿主菌BL21，誘導獲得FXYD6重組蛋白可溶性的高效表達。因重組蛋白有His標簽，本研究選用鎳柱純化蛋白，重組蛋白與鎳柱結合力較弱，選用30 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白，濃縮、超濾換PBS液后，獲得高純度的FXYD6重組蛋白。

LIU等[15]制備的單抗不能識別天然構象的抗原蛋白，為非功能性胞外區單抗。基于此，本研究用純化的重組FXYD6抗原免疫小鼠，制備針對胞外區或胞內區的單克隆抗體，同時以期獲得識別天然構象功能性胞外區單克隆抗體。本實驗采用小鼠直接脾內注射免疫的方法，此法周期短，抗原直接接觸免疫細胞，有免疫原性和反應性強的特點[11]。加強免疫后，將小鼠骨髓瘤細胞和脾淋巴細胞融合，篩選出融合的雜交瘤細胞株后再用標簽蛋白篩選去除對標簽蛋白或串聯多肽序列有陽性反應的雜交瘤，即得到分泌針對FXYD6胞內區或胞外區單抗的雜交瘤，BSA-FXYD6胞外區多肽篩選出分泌胞外區單抗雜交瘤細胞株。在對FXYD6胞外區單抗特異性鑒定中發現：制備的單抗與其他FXYD蛋白無明顯交叉反應；可以特異性識別腦組織中的FXYD6蛋白。本研究還發現FXYD6蛋白在肝癌組織中高表達；FXYD6胞外區單克隆抗體可以特異性識別天然構象的FXYD6蛋白。

近期研究發現FXYD6蛋白與多種腫瘤相關，FXYD6過表達可促進肝癌細胞和骨肉瘤細胞侵襲與轉移[8,10]。在對FXYD6胞外區單抗功能進行研究的實驗中，本研究發現其可抑制高表達FXYD6蛋白的肝癌HepG2細胞增殖，其抑制作用與制備的胞外區單抗有一定的濃度依賴性，胞外區單抗屬于阻斷性抗體，然而高濃度單抗較中濃度單抗抑制細胞增殖作用無明顯差異。

總之，本研究成功制備了分泌針對FXYD6胞內區或胞外區的單抗雜交瘤細胞株，并制備了FXYD6胞外區功能阻斷性單抗，這為研究FXYD6蛋白的組織分布、具體作用機制和一些腫瘤的靶向治療奠定了良好基礎。

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