原花青素對腦出血后腦水腫及繼發(fā)性腦損傷炎癥的作用研究

石 磊,趙 焱,徐治強,王建祥,彭 翔

(湖北省武漢市普愛醫(yī)院神經(jīng)外科 430033)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指腦實質(zhì)的非創(chuàng)傷性出血，是一種嚴(yán)重危害人們健康的疾病，常發(fā)生于50歲以上患者，占急性腦血管病的20%～30%。我國每年因ICH死亡的人數(shù)高達(dá)100萬，在急性腦血管病中病死率最高[1]。無論保守治療還是手術(shù)治療，腦血管病病情的惡化均與ICH后腦水腫和繼發(fā)性腦損傷密切相關(guān)[2]。然而，目前尚缺乏有效的預(yù)防手段及治療腦水腫及繼發(fā)性腦損害的藥物。原花青素是一大類多酚化合物的總稱，具有強效的抗氧化作用，且具有抗炎、抗糖尿病、保護缺血性腦損傷、保護心血管等藥理作用，是極具發(fā)展前景的天然植物提取物[3]。本研究探討原花青素對ICH后腦水腫及繼發(fā)性腦損傷的影響及其機制，進(jìn)一步明確原花青素的藥理作用及應(yīng)用前景，為預(yù)防及治療ICH后繼發(fā)性腦損傷提供一定的實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：健康C57BL6雄性小鼠48只，體質(zhì)量(250±30)g，由湖北省實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)室為屏蔽環(huán)境，控制室溫約為22 ℃，室內(nèi)濕度約為55%。動物實驗過程符合實驗動物倫理學(xué)要求。試劑：原花青素(含量大于95%，Solarbio公司，中國)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體及小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)抗體(Abcam公司，英國)，正置顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2方法

1.2.1動物模型分組及給藥 根據(jù)前期實驗摸索，原花青素濃度使用中濃度(100 mg/kg)比較合適。8月齡健康C57BL6雄性小鼠分為4組，Sham+生理鹽水組、Sham+原花青素(100 mg/kg)組、ICH+生理鹽水組、ICH+原花青素(100 mg/kg)組。4組小鼠分別灌胃給藥7 d后取材。

1.2.2ICH模型制備 C57BL6小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉后，暴露前囟，將小鼠放置于立體定位儀上，在前囟后0.2 mm，中線右3.0 mm處鉆孔，微量加樣器沿顱骨孔垂直進(jìn)針6.0 mm，緩慢注入自體尾動脈血20 μL，對照組注入等量的生理鹽水。手術(shù)結(jié)束后記錄時間，各組小鼠正常飲食，分籠飼養(yǎng)。

1.2.3神經(jīng)功能評分 觀察術(shù)后各組小鼠，Bederson法對神經(jīng)功能進(jìn)行初步評估[4]。Bederson法：輕抓尾巴，提起高于桌面10 cm，正常小鼠前爪伸直。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：腦部病變對側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分：上述體征+向麻痹側(cè)推阻力下降；3分：活動是向麻痹側(cè)打圈(追尾狀)。以造模后4、8、12、24 h為時間點，對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

1.2.4干濕比重法測定腦組織含水量 造模后24 h處死小鼠，在冰盤上斷頭取腦，用冰生理鹽水沖洗3次，洗去積血。迅速切取進(jìn)針孔前半部分腦組織，精確稱重(0.1 mg)。然后將稱好的腦組織置于恒溫烘干箱中烘干，準(zhǔn)確稱取干重。根據(jù)Elliott公式計算腦組織含水量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色 造模后24 h向小鼠腹腔注射4%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，迅速開腔，從右心耳先后灌注0.9%生理鹽水約150 mL，4%多聚甲醛約300 mL。待徹底灌注完成后，斷頭取腦，切取部分腦組織，進(jìn)行組織包埋、切片及HE染色，顯微鏡下觀察出血區(qū)及周圍的神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)改變。

1.2.6Western blot檢測 取各組小鼠腦海馬區(qū)組織，將其剪成細(xì)小碎片，按250 μL/20 mg將含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液加入碎片組織，使用勻漿器將其勻漿至完全裂解。然后將完全裂解的組織樣本置入4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)跑膠，然后轉(zhuǎn)膜，利用一抗GFAP抗體(1∶200)、Iba-1抗體(1∶1 000)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(1:500)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(1∶500)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(1∶500)室溫孵育1 h后，磷酸鹽緩沖液吐溫20(phosphate buffered solution Tween-20,PBST)洗滌，用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗(1∶200)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次。取適量電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液膜正面進(jìn)行顯色處理后在化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測。

1.2.7TUNEL染色 石蠟包埋的組織切片經(jīng)脫蠟水化后，滴加蛋白酶K室溫孵育20 min后，加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒暗室中37 ℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，再加入50 μL轉(zhuǎn)化-POK，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加50 μL二氨基聯(lián)。

2 結(jié) 果

2.1原花青素對ICH小鼠神經(jīng)功能的作用 術(shù)后Sham各組小鼠出現(xiàn)輕微不適，但沒有明顯神經(jīng)功能缺損癥狀。ICH各組小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀比較嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為前肢肘關(guān)節(jié)屈曲、不停地轉(zhuǎn)圈、偏癱，神經(jīng)行為學(xué)評分比較有差異。在4 h時間點，ICH+原花青素組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分有所降低，但與Sham+原花青素組小鼠相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；12 h后，與ICH+生理鹽水鼠相比，ICH+原花青素組小鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2原花青素對ICH小鼠腦組織含水量的影響 與Sham+生理鹽水組[(75.65±0.74)%]比較，ICH+生理鹽水組小鼠[(83.16±1.09)%]腦含水量明顯升高(P<0.05)。而原花青素給藥治療后，與ICH+生理鹽水組比較，ICH+原花青素組小鼠[(80.38±0.98)%]腦組織含水量有明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 ICH小鼠不同時間點神經(jīng)功能評分

2.3原花青素對ICH小鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)的改變 Sham+生理鹽水組的小鼠腦組織結(jié)構(gòu)相較正常，形態(tài)正常，細(xì)胞著色均勻，排列整齊，沒有明顯出血癥狀。ICH+生理鹽水組小鼠神經(jīng)細(xì)胞腫脹變形，出現(xiàn)自溶空泡現(xiàn)象，并且有大量紅細(xì)胞血塊聚集，血塊周圍組織松散，細(xì)胞核固縮。原花青素給藥后，ICH+原花青素組小鼠神經(jīng)細(xì)胞變形發(fā)生空泡數(shù)量減少，紅細(xì)胞聚集明顯降低，組織結(jié)構(gòu)趨近緊密，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減少,見圖1。

2.4原花青素對ICH小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的作用 Sham+生理鹽水組和Sham+原花青素組小鼠海馬區(qū)腦組織偶見凋亡細(xì)胞，ICH+生理鹽水組小鼠海馬區(qū)腦組織見大量凋亡細(xì)胞表達(dá)，多見于高密度細(xì)胞層，染色質(zhì)濃縮，核固縮。與ICH+生理鹽水組小鼠比較，ICH+原花青素組小鼠海馬區(qū)腦組織細(xì)胞凋亡密集度較低，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮程度偏低，染色陽性的棕黃色顏色相對較淺，細(xì)胞凋亡數(shù)較少，見圖2。

2.5Western blot檢測 ICH發(fā)生后，小鼠腦細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax和Caspase-3表達(dá)上調(diào)，腦組織細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。原花青素給藥后，ICH小鼠腦細(xì)胞Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax和Caspase-3表達(dá)下調(diào)；ICH小鼠腦組織GFAP和Iba-1表達(dá)上調(diào)，而原花青素給藥治療后，ICH小鼠腦組織GFAP和Iba-1表達(dá)下調(diào)，見圖3。

A：Sham+生理鹽水組；B：Sham+原花青素組；C：ICH+生理鹽水組；D：ICH+原花青素組

A：Sham+生理鹽水組；B：Sham+原花青素組；C：ICH+生理鹽水組；D：ICH+原花青素組

A：Western blot凝膠圖；B：細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)水平；C：細(xì)胞GFAP和Iba-1的表達(dá)水平

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞針對受損的細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)等作用[5]，但小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活后會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響[6]。Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，ICH發(fā)生后血腫周圍的細(xì)胞破壞裂解后釋放大量的三磷酸腺苷(ATP)，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞在ICH后異常活躍，并且可以檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎癥因子，對血灶周圍的正常細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性及炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)腦細(xì)胞的凋亡壞死[8]。本研究結(jié)果發(fā)生ICH后，腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1表達(dá)明顯升高，與之前研究結(jié)果一致。

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,Ast)是中樞神經(jīng)內(nèi)數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦缺血時的主要受累細(xì)胞[9]。在受到創(chuàng)傷及腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化適應(yīng)損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增加，突起長度變化[10]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，主要分布在活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中[11]。活化的Ast產(chǎn)生大量的NO，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡壞死，介導(dǎo)細(xì)胞的炎性反應(yīng)[12]。因此星形膠質(zhì)細(xì)胞對ICH引發(fā)的腦水腫和繼發(fā)性腦損傷具有重要研究意義。這與本研究結(jié)果ICH發(fā)生后星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)明顯升高一致。

原花青素來自于傳統(tǒng)中藥-蓮、松樹皮等，是一種強效的抗氧化劑，是極具發(fā)展前景的天然植物提取物。近來有研究表明，原花青素有較強的清除自由基，抗腫瘤，預(yù)防動脈粥樣硬化、降脂、降壓，以及改善人體微循環(huán)等多重功效[13-16]。原花青素可以通過減輕腦水腫、抗炎、抗氧化及抑制缺血腦組織ASIC1a的表達(dá)，有效減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷[17]。與本研究結(jié)果原花青素可以緩解腦出血后神經(jīng)功能損傷，降低腦出血后腦組織含水量和腦組織出血量，通過促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax和Caspase-3表達(dá)進(jìn)而抑制腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡一致。

綜上，原花青素能緩解ICH后腦組織水腫癥狀，對ICH小鼠的腦損傷有一定的保護作用，其機制可能是因為原花青素能夠通過降低GFAP和Iba-1的表達(dá)，減少膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量，抑制神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，減輕腦水腫及細(xì)胞凋亡進(jìn)而緩解繼發(fā)性腦損傷。

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