蒙藥蒙古山蘿卜花中總黃酮的含量測定方法△

金 蓉 賽 那 蘇曉麗 郭 偉 劉 暢 馬月宏* 周海霞

(1.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110;2.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110； 3.內蒙古包頭市北方重工集團醫院，內蒙古 包頭 014030)

蒙古山蘿卜花，又稱藍盆花，別名輪鋒菊，松蟲草[1]，為川續斷科藍盆花(山蘿卜)屬植物。約100種，產于歐洲、亞洲、非洲南部和西部，主產地中海地區。我國有9種2變種，主要分布于內蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等省。《中華人民共和國衛生部藥品標準》(蒙藥分冊)[2]中規定作為正品藥用，該蒙藥味甘、澀，性鈍、燥、膩、重、涼，具解熱、清“協日”之功效，蒙醫臨床用于肺熱、肝熱、咽喉熱等，主治肝火頭痛、發燒、肺熱咳嗽、黃疸等病[3]；藏醫多用于肺熱、肝熱、咽喉熱等疾病的治療。

現代藥理研究表明蒙古山蘿卜花植物中所含化學成分類型較多，主要有黃酮類、三萜類、環烯醚萜、香豆素類、酚類、有機酸和揮發油等結構類型[4]。藥理作用有解熱抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、鎮靜、增強免疫、抗菌、保護腎臟、減肥等功能[5]，尤其是在抗氧化和抑菌等方面效果顯著[6]。主要有效成分為黃酮類和三萜類[7]。因此，我們很有必要建立一種經濟、快捷的蒙古山蘿卜花中總黃酮的體外含量測定方法，為進一步探究其體內藥物動力學過程及作用機制研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 蒙古山蘿卜花藥材購自天康蒙藥有限公司，生產批號：20140418，20150729；經內蒙古醫科大學藥學院生藥教研室及蒙醫藥學院蒙藥炮制實驗室鑒定為川斷續科植物華北藍盆花的干燥花序。蘆丁對照品(中國藥品生物制品鑒定所)；其余試劑均為分析純。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；ZTB-B磁力攪拌電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；RE-201D旋轉蒸發儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)；SHZ-CA循環水式多用真空泵(鞏義市英峪儀器廠)；sigma3-18高速低溫離心機。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10.0mg，置于50mL容量瓶中，加入10%的乙醇適量，超聲使溶解，再加入30%乙醇，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為200mg·L-1蘆丁對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將干燥蒙古山蘿卜花藥材粉粹后過40目篩，制成實驗中所使用的蒙古山蘿卜花藥材粗粉。精密稱定蒙古山蘿卜花粗粉17g，加70%乙醇200mL，加熱回流1h，抽濾，濾渣用70%乙醇洗滌，在旋轉蒸發儀中濃縮至約200mL，得到的濃縮液用70%乙醇定容于250mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，備用。精密量取蒙古山蘿卜花提取液1mL，置于200mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.3 測定波長的選擇 精密量取1.2.1項下蘆丁對照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，加30%的乙醇至6.0mL，在加5%的亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加10%的硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加10%的氫氧化鈉溶液10.0mL，加30%乙醇至刻度，搖勻，放置10min。以相應的試劑作空白，于分光光度計200～800nm波長范圍內進行掃描。得出在509nm處有最大吸收，故選擇509nm波長作為測定波長。

1.2.4 標準曲線的繪制[8]精密稱取蘆丁對照品10mg，加10%乙醇溶解，室溫下超聲10min，轉入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容即得對照品溶液。精密吸取該3.0mL，4.5mL，6.0mL，7.5mL，9.0mL，10.5mL分別置于25mL容量瓶中加30%乙醇至10.5mL，按1.2.3項下“加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL”。放置10min后，以相應試劑做空白，于509nm波長處測定吸光度。以濃度(C)與吸光度(A)進行直線回歸。實驗數據附圖1，得到回歸方程為Y=0.0076X+0.0404(R=0.9997)。

表1 標準曲線實驗數據

圖1標準曲線

1.2.5 精密度實驗 精密量取1.2.1項下蘆丁對照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按1.2.3項下“加5%亞硝酸鈉液1.0mL”。放置10min后，以相應試劑做空白，于509nm波長處測定吸光度。連續測定5次，計算精密度，結果測得吸光度的RSD為0.056%，(n=5)，表明精密度良好。

1.2.6 穩定性實驗 精密量取1.2.1項下蘆丁對照品溶液1.0mL于25mL容量瓶中，按1.2.3項下“加5%亞硝酸鈉液1.0mL”。放置10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，以相應試劑做空白，于509nm波長處測定吸光度。測定同一試液在不同時間的總黃酮含量，以判斷試液的穩定性，結果表明，樣品的吸光度在30min內保持穩定。

1.2.7 重現性實驗 精確量取2mL1.2.1項下蘆丁對照品溶液，5份于50mL容量瓶中，同2.1.5項下處理，以相應試劑做空白，于509nm波長處分別測定5份溶液的吸光度，計算重現性，結果測得吸光度的RSD為0.42%，(n=5)，表明重現性良好。

1.2.8 回收率實驗 精確量取1.2.2中供試品溶液0.3mL，平行3份；精確量取1.2.1中蘆丁對照品溶液0.5mL，平行3份，分別置于25mL容量瓶中。加30%乙醇至7.0mL，再按1.2.3項下“加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL”，加30%乙醇至刻度，搖勻后放置10min，依法測定吸光度值，從標準曲線上讀出各組濃度(mg·L-1)，計算回收率，實驗數據見表2。

表2 回收率實驗數據

2 含量測定

精密量取1.2.9中含測溶液0.3mL，置于25mL容量瓶中，加30%乙醇至7.0mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻后放置6min；再加入10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻后放置6min；最后加10%氫氧化鈉溶液10mL，加30%乙醇至刻度，搖勻后放置10min，以相應的試劑做空白，于波長509nm處測定吸光度，計算總黃酮的含量在4.0%以上。

表3 含量測定結果

3 討論

本實驗中采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系，其原理是先以NaNO2還原黃酮類化合物，再加Al(NO3)3絡合，最后加NaOH溶液顯色，產生紅色化合物進行比色測定。該顯色體系具有一定的局限性，其限定測定波長為500～510nm，并且一般采用的對照品多為蘆丁[9]。在實驗過程中由于3種試劑加入的量不同，步驟繁瑣，所以可以進一步將該顯色體系的試劑加入量進行正交優化。對于提取方法的考察，參考趙子龍等對于天然植物中總黃酮的提取方法研究[10]，選用了乙醇回流提取法，加入乙醇濃度70%，提取時間1h，提取次數1次。選取2個不同批號的蒙古山蘿卜花中藥飲片，其中總黃酮的含量均在4%以上。

[1]國家中醫藥管理局中華草本編委會.中華本草·蒙藥卷[M].上海：上海科學技術出版社，2004:385.

[2]中華人民共和國衛生部．中華人民共和國衛生部藥品標準:蒙藥分冊[S]．1998: 52.

[3]麻劍南.蘋果梨果皮和藍盆花的化學成分及生物活性研究[D].呼和浩特：內蒙古大學，2015.

[4]珠日根，李福全.蒙藥藍盆花化學成分和藥理作用研究進展[J].中國民族民間醫藥，2012：4-5.

[5]王國英，薛培鳳.蒙藥藍盆花及其同屬植物的研究進展[J].內蒙古醫學院學報，2009,31(5)：487-490.

[6]黎田兒，歐陽輝，楊林軍，等.藍盆花屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21(18)：226-230.

[7]韓丹，羅素琴，劉樂樂，等.蒙藥藍盆花有效成分的初步研究[J].內蒙古醫學院學報，2009,31(3)：279-281.

[8]王國英，薛培鳳，高汝燕，等.紫外可見分光光度法測定蒙藥藍盆花中總黃酮的含量[J].2010,32(2)：219-222.

[9]何珺，顏仁梁，劉志剛.NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮應用中的常見問題[J].今日藥學，2009,19(12)：18-20.

[10]趙子龍，薛培鳳，倪佩東，等.天然藥物中總黃酮的提取工藝研究進展[J].內蒙古醫學院學報，2012,34(6)：512-515.