苗藥烏蕨提取物抗炎作用及其機(jī)制研究

陳 明 王 恒 趙鴻賓 余躍生 段 萍

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000； 2. 黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 都勻 558000)

烏蕨(Stenoloma chusanum (L)Ching)系鱗始蕨科烏蕨屬植物,廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南許多省份[1]，為貴州省苗族習(xí)用藥材，苗語(yǔ)稱其為空麻昌、豆麻昌[2][3]。該藥主要以野生為主，資源十分豐富，也可進(jìn)行人工種植。民間長(zhǎng)期用其治療外傷感染。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,該藥的化學(xué)成分包括黃酮類、酚類、揮發(fā)油、甾體和多糖等[4][5]，有明顯的抗菌活性,能用于多種炎癥的治療[6]，但目前還沒有關(guān)于該藥抗炎作用機(jī)制方面的研究報(bào)導(dǎo)，對(duì)其藥理作用的研究也不夠全面、深入。本研究旨在驗(yàn)證烏蕨提取物的抗炎作用，并探究其作用機(jī)制，在比較常用抗炎藥物阿司匹林與烏蕨提取物的抗炎作用后，我們可以初步肯定苗藥烏蕨在抗炎方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料

1.1 動(dòng)物 選用昆明種小鼠100只，標(biāo)準(zhǔn)為：健康，體質(zhì)量在18～22g范圍內(nèi)，雌雄各半。由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(黔)2012-0001。

1.2 藥材與試劑 烏蕨原植物采自貴州省都勻市馬鞍山林區(qū)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校中藥教研室魏學(xué)軍教授鑒定為鱗始蕨科烏蕨屬植物(Stenoloma chusanum (L)Ching)。二甲苯、阿司匹林購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；伊文斯藍(lán)，批號(hào)：DJ1405WL；環(huán)氧化酶(COX-2)，批號(hào)：201508；前列腺素(PGE2)，批號(hào)：201508；腫瘤壞死因子α(TNF-α)，批號(hào)：201508；一氧化氮(NO)，批號(hào)：201508；試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限責(zé)任公司(From Sigma)。其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀，芬蘭Lab-systems公司；TDL-4ZB型臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器廠；BS223型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Agilent Cary 100型分光光度計(jì),美國(guó)安捷倫公司。

2 方法

2.1 烏蕨提取物的制備 取干燥的烏蕨藥材(地上部分)粉碎過(guò)篩，稱取1000g，用15倍量65%乙醇，80℃水浴回流提取3次，1h/次，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加石油醚萃取5次，將母液減壓蒸發(fā)除去石油醚，然后加入等體積乙酸乙酯，萃取4～6次，合并乙酸乙酯萃取液，將其減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯萃取物，減壓干燥；稱取干燥的乙酸乙酯萃取物適量，加少量水溶解，加適量吐溫80，配制成以浸膏計(jì)濃度為4.42mg.mL-1溶液,供實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 阿司匹林對(duì)照液的制備 取阿司匹林0.5011g，置100mL量瓶中，加純化水適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 烏厥提取物對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響[7]取健康昆明種小鼠50只，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。具體分組情況如下：阿司匹林對(duì)照組(100mg·kg-1)、烏蕨提取物低劑量組(22.1mg·kg-1)、烏蕨提取物中劑量組(44.2mg·kg-1)、烏蕨提取物高劑量組(88.4mg·kg-1)、正常對(duì)照組(生理鹽水20mL·kg-1)。連續(xù)給藥7d，每天ig給藥1次。在最后一次給藥后1h，將小鼠右耳耳廓均勻涂抹二甲苯(0.05mL/只，正、反面均需涂抹)致炎，左耳不涂作為對(duì)照，30min后摘除眼球，取血保存?zhèn)溆谩ｋS即采用頸椎脫臼法將小鼠處死，使用打孔器在小鼠左、右耳廓相同部位打下直徑9mm圓耳片，立即準(zhǔn)確稱取耳片質(zhì)量。右耳與左耳重量之差即為腫脹度。腫脹抑制率計(jì)算方法如下：

腫脹抑制率(%)=

2.4 烏厥提取物對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響[8]：冰乙酸的主要作用是增加小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，使靜脈內(nèi)的伊文思藍(lán)滲出，測(cè)定腹腔洗液的OD值可反映毛細(xì)血管通透情況。

按前文2.3方法進(jìn)行分組及給藥。最后一次給藥1h后，采用尾靜脈注射法注射1%伊文斯藍(lán)(20mL·kg-1)，隨后腹腔注射0.7%冰乙酸(20mL·kg-1)，間隔30min后摘除小鼠眼球，取血，保存?zhèn)溆谩Ｍ瓿缮鲜霾僮骱螅⒓床捎妙i椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔將6mL生理鹽水注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行腹腔充分清洗，吸出腹腔洗液，離心10min(1500rpm)。取離心后的上清液在590nm處測(cè)定吸光度(OD值)。

2.5 血清制備及指標(biāo)分析 各小鼠血液靜置30min后，3000rpm，離心半徑為5cm，離心15min，取血清。按檢測(cè)要求分裝，置冰箱保存(-20℃)備用。根據(jù)COX-2、PGE2、TNF-α、NO說(shuō)明書測(cè)定并計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 烏蕨提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 小鼠右耳涂抹二甲苯后，耳腫脹明顯。阿司匹林對(duì)照組和烏蕨提取物中劑量組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 烏蕨提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

本研究結(jié)果顯示，阿司匹林組及烏蕨提取物中劑量組能夠極顯著的降低COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平(P<0.01)；烏蕨提取物高劑量組能夠顯著降低COX-2和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 烏蕨提取物對(duì)二甲苯致耳腫脹小鼠血清COX-2、PGE2、 TNF-α、NO的影響

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

表3 烏蕨提取物對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

3.2 烏蕨提取物對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿司匹林組及烏蕨提取物各劑量組OD值與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。阿司匹林及烏蕨提取物均可顯著抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性。見表3。

同時(shí)研究結(jié)果提示，阿司匹林組及烏蕨提取物中劑量組能夠顯著地降低COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平 (P<0.05或P<0.01)；烏蕨提取物高劑量組能夠顯著降低COX-2和TNF-α水平(P<0.01)；烏蕨提取物低劑量組能夠顯著降低COX-2水平(P<0.01)。烏蕨提取物中劑量組在降低血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平方面與阿司匹林相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

4 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)損傷因子所發(fā)生的復(fù)雜的防御反應(yīng)，炎癥反應(yīng)時(shí)血管系統(tǒng)的一系列改變是其防御作用的關(guān)鍵，也是炎癥過(guò)程的中心環(huán)節(jié)。在此過(guò)程中炎癥部位的充血和滲出，有利于稀釋毒素、殺傷和包圍損傷因子，達(dá)到消滅致病因子的目的。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子眾多,主要包括白細(xì)胞介素、趨化因子、生長(zhǎng)因子、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子等。細(xì)胞因子具有多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性等多種生理特性,參與多種生理功能調(diào)節(jié)[9-10]，其發(fā)揮作用的途徑主要包括旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式 。炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體在產(chǎn)生保護(hù)作用的同時(shí)也有可能產(chǎn)生傷害，比如可直接或間接損傷機(jī)體的細(xì)胞和組織，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)還可危及生命。

表4 烏蕨提取物對(duì)腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)小鼠血清COX-2、PGE2、 TNF-α、NO的影響

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05,2)P<0.01

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹模型，發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物(中劑量組)對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物(中劑量組)能夠極顯著地降低耳腫脹模型小鼠血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平(P<0.01)；烏蕨提取物(高劑量組)能夠顯著降低耳腫脹模型小鼠血清COX-2和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。

通過(guò)冰乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型，發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物各劑量組OD值與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)烏蕨提取物(中劑量組)能夠顯著地降低腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型小鼠血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平 (P<0.05或P<0.01)；烏蕨提取物(高劑量組)能夠顯著降低小鼠血清COX-2和TNF-α水平(P<0.01)；烏蕨提取物(低劑量組)能夠顯著降低小鼠血清COX-2水平(P<0.01)。

綜上所述，烏蕨提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，能夠顯著降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性。烏蕨提取物在一定劑量下能顯著抑制小鼠血清中COX-2、PGE2、TNF-α、NO等炎癥因子濃度，烏蕨提取物(中劑量組)在降低血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平方面與阿司匹林相似。推測(cè)烏蕨提取物的作用機(jī)制可能與減少炎癥因子的合成與釋放有關(guān)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的烏蕨提取物中劑量組抗炎作用強(qiáng)于高劑量組這一現(xiàn)象，在中草藥作用機(jī)制的研究中經(jīng)常出現(xiàn)，其原因有待進(jìn)一步研究。

[1]陳明,陳金秀,段 萍.烏蕨的毒理學(xué)系列研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2000,6:48-50.

[2] 包駿，冉懋雄.貴州苗族醫(yī)藥研究與開發(fā)[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，1999，8.

[3] 汪毅.中國(guó)苗族藥物彩色圖集[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2002，11.

[4] 岳銀,楊加竹,陳業(yè)高.烏蕨的化學(xué)成分及活性研究進(jìn)展[J].廣州化工, 2013,4l(17):41-43.

[5] 陳明,段 萍,趙鴻賓,等.烏蕨中黃酮類成分提取分離方法的研究進(jìn)展[J].黔南民族醫(yī)專學(xué)報(bào),2014,27(2):84- 86.

[6] 岳銀,楊加竹,陳業(yè)高.烏蕨的化學(xué)成分及活性研究進(jìn)展[J].廣州化工, 2013,4l(17):41-43.

[7] 任非,袁志芳,段坤峰,等.馬鞭草提取物的鎮(zhèn)咳、抗炎和祛痰作用研究[J].中國(guó)藥房,2013,24(31):2887-2890.

[8] 項(xiàng)娟娟.金桔膠囊抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰和免疫增強(qiáng)的藥理學(xué)作用[J].中國(guó)藥房,2014,25(11):1003-1005.

[9] Artis D, Spits H. The biology of innate lymphoid cells[J]. Nature,2015,517:293 -301.

[10] Braumüller H, Wieder T. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence[J]. Nature,2013,494:361-5.