吳茱萸次堿通過SIRT1通路干預氧化應激誘導血管平滑肌細胞增殖的作用

馬 懿 吳賽珠 阮云軍 蘇 雙

(遵義醫學院附屬醫院，貴州 遵義 563000)

氧化應激損傷是心血管疾病重要的致病因素，在動脈粥樣硬化(AS)形成與粥樣斑塊破裂的過程中，血管內皮細胞和平滑肌細胞的結構與功能會發生一系列的改變〔1〕。吳茱萸次堿是蕓香科植物吳茱萸中一種重要生物活性堿，主要存在于吳茱萸及同屬植物石虎的果實、根莖等部位中，在傳統中醫藥中廣泛使用〔2〕。其除具有抗炎、抑制癌基因、抗缺血等藥理學效應外，還有抑制血小板聚集的心血管保護作用〔3〕。沉默信息調節因子(SIRT)1是真核細胞生物普遍表達的去乙酰化蛋白，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)協同去乙酰化反應，可增加胞內NAD含量從而提高SIRT1的活性〔4〕。研究發現，SIRT1能調控機體細胞新陳代謝，維持血管內皮細胞周期穩態，抑制氧化應激誘導的細胞衰老與凋亡，可作為哺乳動物的一種長壽預測因子〔5〕。本研究旨在觀察吳茱萸次堿在氧化應激下發揮抗細胞增殖的效應作用，并探討與SIRT1的初步聯系。

1 材料和方法

1.1細胞原代與傳代培養 實驗用3月齡雄性Wistar大鼠由南方醫科大學實驗動物中心提供。無菌超凈臺分離胸主動脈，去除外膜沿血管軸縱行剪開血管刮去內皮剪成碎片，平鋪于培養瓶上，加入15%胎牛血清培養液，置于含5%CO237℃電熱恒溫孵育箱，2～3 h后翻瓶培養，每2～3天換液1次，視細胞密度以1∶2～1∶3比例分瓶培養，待細胞在培養瓶形成致密單層時即可傳代。

1.2實驗分組 取傳至4～6代血管平滑肌細胞(VSMCs)，以2×104個/ml的細胞數接種于96孔板，每孔100 μl。實驗分組：①空白組：僅加入培養基；②叔丁基過氧化氫(t-BHp)組：80 μmol/L t-BHp處理細胞24 h；③吳茱萸次堿組：10 μmol/L吳茱萸次堿預處理2 h后，再加入80 μmol/L t-BHp處理24 h；④EX-527組：10 μmol/L EX-527預處理細胞2 h〔6〕，其余處理同吳茱萸次堿組。每組設5個平行對照。

1.3主要試劑 吳茱萸次堿(純度>98%)購于中國國家藥品與生物制品研究所；t-BHp、EX-527購于美國Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；SIRT1一抗購于美國Cell Signaling Technology公司；二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)熒光探針由美國Invitrogen生物技術公司提供；縮膽囊素八肽(CCK-8)試劑盒與辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4細胞增殖率檢測 將干預終點細胞在96孔板，加入100 μl CCK-8工作液，置于37℃恒溫箱孵育過夜，次日避光采用酶標儀檢測各細胞標本450 nm處的吸光度值。

1.5MDA、SOD與活性氧(ROS)水平檢測 RIPA裂解液裂解細胞后，使用BCA試劑盒蛋白定量。MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD采用水溶性四氮唑(WST-1)法，嚴格按試劑盒說明書操作。將DCFH-DA熒光染料用無血清培養基稀釋成工作液濃度10 μmol/L，培養基洗滌細胞后直接加入DCFH-DA，在CO2培養箱37℃下避光孵育細胞1 h。孵育結束后用培養基洗滌細胞去除胞外熒光物質，檢測熒光強度。DCFH-DA的激發波長和發射波長分別為488 nm和525 nm。綠色熒光與細胞內ROS水平呈正相關，強度表示ROS濃度水平。

1.6real-time PCR法檢測SIRT1 mRNA表達 使用Trizol裂解細胞提取總RNA、經異丙醇沉淀及乙醇洗滌后，用微量分光光度計定量，A(260)/A(280)及總RNA濃度。各組分別取2 μg總RNA，使用DEPC水溶解，在PCR儀中進行逆轉錄反應，收集逆轉錄獲得cDNA產物置于-20℃保存。采用real-time PCR儀進行實時定量PCR反應。qPCR反應體系包括：cDNA 4 μl、2×SYBR Master Mix 12.5 μl、引物各1 μl、Taq酶0.15 μl、三蒸水6.35 μl。各基因的引物分別為：SIRT1 正義鏈5'-ACA ACC TCC TGT TGG CTG ATG AGA-3' 反義鏈5'-AGA ATT GTT CGA GGA TCG GTG CCA-3'；β-actin 正義鏈5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3' 反義鏈5'-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'。SIRT1 mRNA表達量是與β-actin表達比值的相對值。

1.7Western印跡法檢測SIRT1蛋白表達 各取80 μg蛋白煮沸5 min，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉移至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%脫脂奶粉封閉液(pH7.5，Tris-HCl 10 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，0.1% Tween 20)中室溫封閉2 h，加一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，次日取出PVDF膜用TBST搖床洗膜10 min×3次，按1∶5 000稀釋羊抗兔生物素標記二抗室溫下搖床孵育，再次洗膜3次，然后電化學發光(ECL)底物化學顯色，上機掃描儲存圖像。采用Image J軟件進行條帶定量分析。

1.8統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行分析，組間比較方差齊時用單向方差分析LSD法檢驗，方差不齊時采用DunnettT3檢驗。

2 結 果

2.1各組SOD、MDA含量及ROS水平比較 與空白組比較，t-BHP組SOD含量顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，ROS水平顯著升高(P<0.05)；與t-BHp組比較，吳茱萸次堿組SOD含量明顯增高(P<0.05)，而MDA含量顯著下降(P<0.05)，ROS水平顯著降低(P<0.05)；與吳茱萸次堿組比較，EX-527組SOD含量顯著下降(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)，ROS水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組MDA、SOD含量及ROS水平比較

與空白組比較：1)P<0.05；與t-BHp組比較：2)P<0.05；與吳茱萸次堿組比較：3)P<0.05，下表同

2.2各組SIRT1 mRNA與蛋白的表達 與空白組比較，SIRT1 mRNA與蛋白在t-BHp組中的表達顯著減少(P<0.05)；吳茱萸次堿組SIRT1 mRNA與蛋白的表達顯著高于t-BHp組(P<0.05)；與吳茱萸次堿組比較，EX-527組SIRT1 mRNA與蛋白的表達顯著下降(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 Western 印跡檢測各組細胞中SIRT1蛋白表達

組別SIRT1mRNASIRT1蛋白空白組1．09±0．060．69±0．05t?BHp組0．40±0．121)0．28±0．041)吳茱萸次堿組0．87±0．092)0．43±0．082)EX?527組0．57±0．073)0．32±0．063)

3 討 論

AS是中老年人群易患的心血管疾病，其主要特點是動脈管腔的硬化與狹窄，管壁舒張順應性減退，尤其在硬化基礎上形成粥樣斑塊后，脂質代謝障礙，管壁主要構成細胞內皮細胞與平滑肌細胞在生物功能和形態結構上出現病理生理改變，如內皮細胞損傷、VSMCs增殖能力失調等〔7〕。AS進程中的氧自由基產生與血管腔出現的相關病理生理改變之間存在密切聯系。隨AS斑塊進展，大鼠主動脈的氧化應激程度與ROS增加〔8〕，過量生成的ROS會引起血管內皮細胞功能與平滑肌細胞增殖代謝能力異常，細胞抗氧化損傷能力減退促進了冠狀動脈疾病的發生。

有研究發現，VSMCs在不同的疾病環境中的作用不同，在自由基誘導下通過收縮表型向巨噬樣表型轉變，能占據修飾的低密度脂蛋白、游離膽固醇和凋亡細胞而促進粥樣斑塊形成；而在動脈粥樣進展期，可轉化為分泌型表型，具備高增殖能力，抑制氧自由基與氧化性低密度脂蛋白對斑塊的影響，促進細胞外基質產生，這樣能增加斑塊穩定性，阻礙斑塊破裂和AS血栓形成〔9〕。AS演變與一系列氧化應激損傷與ROS等自由基大量產生密切相關。而細胞內這些ROS的重要部分如O2-和H2O2的來源包括了線粒體電子傳遞鏈、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶、過氧化物酶和細胞色素P450系統〔10〕。在VSMCs中ROS能夠促進氧化應激的二次產物如多不飽和脂肪酸、自由醛和生物核心醛等氧化脂質同時參與到自由基的激活過程中。這些活性脂質聚集在病變血管VSMCs中激活高度親電子產物，如丙烯醛、4-羥基壬烯醛(HNE)和POVPC的釋放，增加VSMC的增殖、表型轉換或凋亡〔11〕。

有研究發現，吳茱萸次堿具有廣泛的藥理學效應，如延緩心肌重塑、抗血栓和AS等心血管保護作用，這些作用可能與下調NADPH氧化酶活性，減少ROS產生密切相關〔12〕。而通過吳茱萸次堿的干預可以抑制單核細胞遷移及抑制趨化因子受體(CCR)2、細胞間黏附分子(ICAM)-1，通過促進磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表達，下調膜Fasl表達從而削弱腎素-血管緊張素系統對血管的影響〔13〕，這些在AS的演變中均發揮關鍵作用。

SIRT1是真核生物細胞內普遍表達的去乙酰化蛋白，它能調控細胞周期，改善機體代謝，延緩細胞衰老與凋亡。由于氧化還原激活受到NAD+組蛋白去乙酰化、轉錄因子和輔助激活因子如p53、FOXO、核轉錄因子(NF)-κB、過氧化物酶體增殖活化受體P共激活因子(PGC)-1α和Ku70的調控〔14〕，SIRT1可能是氧化還原調控的操作者。氧化應激在調控SIRT1去乙酰化活性中發揮顯著作用〔15〕。研究表明，SIRT1通過抑制p53依賴的凋亡在氧化應激狀態促進細胞生存，通過去乙酰化抑制p53反式激活。過氧化氫處理能上調SIRT1表達和過氧化氫酶的誘導〔16〕。SIRT1和FOXO3綁定共同應對氧化應激，SIRT1介導的SOD，通過去乙酰化和激活FOXO3轉錄因子〔17〕。SIRT1過表達和特定的藥物激活劑(SRT1720)減少了RelA/p65乙酰化和NF-κB依賴炎癥誘導的氧化應激狀態〔18〕。在氧化應激狀態SIRT1數量減少和活性減低可能導致NF-κB 與FOXO3的乙酰化增加。

本研究結果顯示，通過吳茱萸次堿處理后，能明顯削弱t-BHp誘導VSMCs的SIRT1 mRNA和蛋白表達下降的情況。而反映氧化應激程度的特征性物質MDA含量與ROS水平通過吳茱萸次堿處理明顯下降。另外在實驗中加入SIRT1抑制劑EX-527，上述吳茱萸次堿所表現出來的抗氧化損傷能力、上調SIRT1蛋白表達，改善細胞中SOD含量的保護性作用均被不同程度的抑制。在吳茱萸次堿抑制t-BHp誘導的VSMCs氧化應激損傷中，SIRT1信號通路可能發揮重要作用。

1Kida Y,Goligorsky MS.Sirtuins,cell senescence,and vascular aging〔J〕.Can J Cardiol,2016;32(5):634-41.

2Liu S,Chen DL,Yuan YM,etal.Efficient intracellular delivery makes cancer cells sensitive to nanoemulsive chemodrugs〔J〕.Oncotarget,2017;8(39):65042-55.

3Tan Q,Zhang J.Evodiamine and its role in chronic diseases〔J〕.Adv Exp Med Biol,2016;929:315-28.

4Ma Y,Chen H,He X,etal.NAD+metabolism and NAD(+)-dependent enzymes:promising therapeutic targets for neurological diseases〔J〕.Curr Drug Targets,2012;13(2):222-9.

5Wang F,Chen HZ,Lv X,etal.SIRT1 as a novel potential treatment target for vascular aging and age-related vascular diseases〔J〕.Curr Mol Med,2013;13(1):155-64.

6Ma Y,Gong X,Mo Y,etal.Polydatin inhibits the oxidative stress-induced proliferation of vascular smooth muscle cells by activating the eNOS/SIRT1 pathway〔J〕.Int J Mol Med,2016;37(6):1652-60.

7馬 懿，吳賽珠，龔 勛，等.自噬與血管衰老的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(19):5609-12.

8Magenta A,Greco S,Gaetano C,etal.Oxidative stress and microRNAs in vascular diseases〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(9):17319-46.

9Finney AC,Stokes KY,Pattillo CB,etal.Integrin signaling in atherosclerosis〔J〕.Cell Mol Life Sci,2017;74(12):2263-82.

10Bolzon LB,Dos Santos JS,Silva DB,etal.Apigenin-7-O-glucoside oxidation catalyzed by P450-bioinspired systems〔J〕.J Inorg Biochem,2017;170:117-24.

11Shi Y,Hou X,Zhang X,etal.Inhibition of oxidized-phospholipid-induced vascular smooth muscle cell proliferation by resveratrol is associated with reducing Cx43 phosphorylation〔J〕.J Agric Food Chem,2013;61(44):10534-41.

12Bao MH,Dai W,Li YJ,etal.Rutaecarpine prevents hypoxia-reoxygenation-induced myocardial cell apoptosis via inhibition of NADPH oxidases〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2011;89(3):177-86.

13Peng WJ,Liu Y,Yu YR,etal.Rutaecarpine prevented dysfunction of endothelial gap junction induced by Ox-LDL via activation of TRPV1〔J〕.Eur J Pharmacol,2015;756:8-14.

14Diaz-Gerevini GT,Repossi G,Dain A,etal.Beneficial action of resveratrol:how and why〔J〕?Nutrition,2016;32(2):174-8.

15Kim M,Kwon YE,Song JO,etal.CHFR negatively regulates SIRT1 activity upon oxidative stress〔J〕.Sci Rep,2016;6:37578.

16Conti V,Russomanno G,Corbi G,etal.Aerobic training workload affects human endothelial cells redox homeostasis〔J〕.Med Sci Sports Exerc,2013;45(4):644-53.

17Olmos Y,Sánchez-Gómez FJ,Wild B,etal.SirT1 regulation of antioxidant genes is dependent on the formation of a FoxO3a/PGC-1α complex〔J〕.Antioxid Redox Signal,2013;19(13):1507-21.

18Lv C,Hu HY,Zhao L,etal.Intrathecal SRT1720,a SIRT1 agonist,exerts anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects on chronic constriction injury-induced neuropathic pain in rats〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(5):7152-9.