尿石素B對地塞米松誘導小鼠肌萎縮的改善作用及機制

王叢叢 李 軍 魯飛翔 呂裕霞 劉慶春

(錦州醫科大學武警總醫院聯合培養基地，北京 100039)

肌肉減少綜合征(簡稱肌少癥)是一種隨著年齡增加，表現出的以肌肉質量、力量和功能減退的一種身體狀態〔1〕，直至2016年被正式納入到ICD-10疾病編碼中，標志著醫界正式將其視作一種有獨特特征的疾病。一項在中國社區老人中的調查顯示，按照亞洲診斷標準，60歲以上的男、女性肌少癥患病率分別為8.2%、12.5%〔2〕，而肌少癥是一系列不良結果的獨立危險因素，如影響生活質量，增加跌倒風險，住院天數延長或對多種疾病的預后有不良影響。目前，肌少癥主要有效的預防措施是增加優質蛋白質的攝入(1.0～1.2 g·kg-1·d-1)和加強運動，尚無有效的藥物治療措施〔3〕。有研究表明，經常攝入富含鞣酸和鞣花單寧的漿果及堅果對人體健康大有裨益，有抗腫瘤、抗菌抗炎、心血管代謝、抗氧化、保護神經等作用，但是鞣酸本身不易被小腸吸收，很難發揮作用〔4〕。Seeram等〔5〕發現鞣酸單寧在腸道的代謝產物尿石素A、B普遍存在于體液中，且進食富含鞣酸單寧的食物可以緩解應激期的肌肉損害〔6〕及高脂膳食對肌肉質量的影響〔7〕。因此尿石素可能對肌少癥有潛在的治療作用。本文通過地塞米松誘導的肌少癥模型來研究尿石素對肌少癥的作用，并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、藥物與試劑及儀器 昆明鼠，雄性，32只，SPF級，5～6周齡，體重28.70～34.32 g，購于軍事醫學科學院，合格證號：SCXK-(軍)2012-0004。飼養條件：室溫(21.5±2.0)℃，相對濕度(50±5)%，12/12 h照明節律，自由進食、飲水。地塞米松(國藥集團榮生制藥有限公司，國藥準字H41020036)購自武警總醫院，尿石素B購于上海詩丹德有限公司，組織RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒購于艾德萊有限公司，PCR引物由上海生工有限公司合成。FA1004型電子天平，Echo MRITM小動物體成分分析儀，YLS-13A大小鼠抓力儀，英國Picdrop公司超微量分光光度計，DYY-6D型電泳儀，美國ABI2720型PCR儀，德國QIAGEN Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀。

1.2動物分組及給藥 適應性喂養7 d后，采用系統隨機抽樣法將小鼠分組：①正常組；②模型組，每組16只動物，模型組按照10 mg·kg-1·d-1地塞米松注射液皮下注射，正常組16只給予對應體重的生理鹽皮下注射。待確定模型成功后，各組內分為兩個亞組，分別給予灌胃生理鹽水和50 mg·kg-1·d-1尿石素B。共有正常組，正常給藥組，模型組，模型給藥組。

1.3小鼠體重及體成分測定 小鼠每天測體重，按體重給藥。1 w進行1次體成分測試。即準確稱量體重后，直接把未麻醉的小鼠放置在一定大小的透明塑料動物艙內，然后將動物艙插入Echo MRITM 側面的管狀空間，通過儀器專用的控制和分析軟件進行掃描，測量得到小鼠的瘦體重、脂肪、自由水和總水含量。其中測量得到的瘦體重含量能直接反映小鼠的整體肌肉量。

1.4小鼠抓力測定 使用YLS-13A大小鼠抓力儀，測試前讓小鼠在抓力儀上適應10 min，然后抓住小鼠尾巴，確定小鼠抓牢后，平穩的向后拉，記錄儀器上抓力讀書。測定三次并記錄結果，用最大抓力作為反映肌肉力量的指標。

1.5小鼠腓腸肌蘇木素-伊紅(HE) 造模結束后，處死小鼠，分離小鼠兩側腓腸肌。左側腓腸肌浸入4%多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片。HE染色后，采用LEICA圖像采集系統選取4個視野進行拍片，放大倍數為200倍。每個視野選取10個肌纖維，應用Image J軟件計算出每個肌纖維的橫截面積。

1.6RT-PCR檢測MyoD、MyoG、MuRF-1、Atrogin mRNA表達 取右下肢腓腸肌組織放入無菌Eppendorf管中，加液氮研磨。按照RNA提取試劑盒說明，進行組織RNA的提取。并對提取RNA濃度及純度進行測定，并在反轉錄過程中將RNA的濃度調整一致，達到1 000 ng。按照TUREscript 1st Strand cDNA Synthsis Kit、2×SYBR Green qPCR Mix說明書進行RT-PCR。以GAPDH作為內參基因，正常組基因表達量作為標準，運用2-△△Ct法，計算各組中基因的相對表達水平。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD及DunnettT3法檢驗。

2 結 果

2.1各組小鼠體重及體成分比較 造模結束時，模型給藥組死亡2例，其余均正常。正常組與正常給藥組小鼠穩定體重增加。與正常組比較，模型組及模型給藥組體重明顯下降，脂肪比重明顯增加，筋肉比重明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與模型組給藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 小鼠體重及體成分改變

與正常組比較：1)P<0.05

2.2各組小鼠最大抓力比較 與正常組、正常給藥組最大抓力〔(395.8±78.0)g、(351.0±33.3)g〕相比，模型組與模型給藥組最大抓力均明顯下降，分別為(257.0±27.3)g、(280.4±40.6)g，差異有統計學意義(P<0.05)。正常組、正常給藥組兩組與模型組、模型給藥兩組之間差異有統計學意義(F=12.809，P=0.000)，但兩組內差異無統計學意義(P>0.05)。雖然模型給藥組與模型組最大抓力差異無統計學意義(P=0.772)，但給藥后最大抓力有增加的趨勢。

2.3各組腓腸肌橫截面面積比較 與正常組肌肉的橫截面積〔(537.77±56.08)μm2〕相比，正常給藥組面積稍下降〔(507.82±45.03)μm2〕，但兩組之間差異無統計學意義(P=0.259)。模型組〔(283.39±34.12)μm2〕較正常組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，模型給藥組肌纖維橫截面積則有所上升，為(396.50±40.97)μm2，模型組與模型給藥組之間差異有統計學意義(P<0.05)，但模型給藥組與正常組和正常給藥組間差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積(HE，×200)

2.4肌肉中相關基因mRNA比較 與正常組MyoD、MyoG mRNA表達水平比較，正常給藥組MyoD、MyoG mRNA表達水平分別是正常組1.26，1.24倍，組內差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與模型給藥組則表現出明顯降低，模型組MyoD、MyoG表達水平分別為正常組的0.35、0.24倍，差異有統計學意義(P<0.05)，模型給藥組分別是正常組的0.60、0.87倍，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組MuRF-1與Atrogin mRNA表達水平是正常組的17.66、11.01倍，模型給藥組MuRF-1、Atrogin mRNA則是正常組的4.23、4.05倍，表達水平較模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

肌少癥是增齡相關性疾病，隨著年齡的增長發病率也是逐漸增加的〔8〕。增齡不僅會引起骨骼肌質量的改變，同時也會使激素水平改變、能量蛋白質攝入減少、消化吸收功能下降、營養代謝水平下降、神經-肌肉功能衰退及線粒體、染色體損傷、炎性因子與自由基氧化損傷、細胞凋亡等的改變，這些均可能是影響肌少癥發生的因素〔9〕。其中，增齡性的糖皮質激素水平異常升高與骨骼肌萎縮呈正相關，且增齡性的肌少癥與地塞米松誘導的肌少癥在一定程度上都呈現肌肉質量減少，肌力下降，肌纖維蛋白合成減少、分解加快的狀態，且使肌纖維失去再生能力，兩者的狀態相似〔10〕。研究顯示，糖皮質激素增加蛋白質的降解，主要是通過降低PI3K/Akt信號通路中一些基因的表達，如MyoG、MyoD，減少蛋白質的合成，同時激活泛素-蛋白酶體通路(UPS)和溶酶體自噬系統〔11〕，UPS系統中的泛素活性增加和泛素連接酶水平上升，使蛋白質降解增強，從而造成肌肉萎縮的，其中MuRF-1和Atrogin是UPS通路中的關鍵因素。

尿石素B主要是石榴、葡萄漿果類與堅果如核桃等的代謝產物鞣酸、鞣花單寧在腸道菌群的作用下，產生的系列產物中的一種，包括有尿石素A、B、C、D等，尿石素B是最終產物〔12〕。但由于人體腸道菌群的差異，體內尿石素的含量也存在很大的差異〔13〕。有動物實驗顯示，尿石素對健康是有益處的，不僅有抗炎的作用〔14〕，也能夠維持和提高線粒體及肌肉的功能的作用〔15〕。直接補充尿石素可能是將其作用發揮到最大的一種有效措施。Mena等〔16〕在模擬人體消化系統對尿石素進行研究，表明經口攝入尿石素可以穩定發揮作用。另外，Heilman等〔17〕對尿石素A進行了安全性評估，在急慢性毒理試驗中，均表明按照體重的5%在食物中添加尿石素不會對人體產生危害，這也為我們的試驗提供了依據。

本實驗采用魯飛翔等〔18〕方法并進行改進，建立地塞米松誘導的小鼠肌少癥模型，研究灌胃給予尿石素B對于地塞米松誘導的小鼠肌萎縮模型的影響。與以往研究結果一致〔19〕，本研究結果顯示尿石素B能夠改善地塞米松誘導的小鼠肌萎縮模型，有增加肌肉質量和力量的趨勢，其機制主要是通過抑制泛素蛋白酶通路中的MuRF-1和Atrogin的表達，減輕肌蛋白的降解，同時上調 PI3K/Akt信號通路中MyoD和MyoG的表達水平，增加肌蛋白合成速率。

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