西藏沙棘葉片黃酮含量與生態因子的相關性

李小偉 ，張宏濤，張澤婧

1.寧夏大學西北土地退化與生態恢復重建省部共建國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；3.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070

西藏沙棘（Hippophae tibetanaSchlecht.）是胡頹子科沙棘屬植物，是分布于青藏高原東南緣的一種高山灌木，能與弗蘭克氏菌共生固氮，是人工造林的主要先鋒樹種（廉永善，2000）。其海拔分布范圍為2800～5200 m，主要生長在沙質土壤的河岸或山坡，山谷和高山草甸。近年來，沙棘屬植物引起了全世界的關注，主要是因為它具有較高的藥用和營養價值（Vahid et al.，2004；Tom et al.，2009；Yang et al.，2009；Geetha et al.，2011）。在傳統藏藥和蒙藥中，沙棘屬植物被用于治療病人；在 20世紀 50年代以來，在亞洲和歐洲逐漸出現了許多源于栽培和野生的沙棘醫藥產品，以中國和俄羅斯尤為常見（廉永善，2000）。

目前，大量植物化學研究表明，沙棘屬植物葉片含有有益于人體健康的黃酮物質（廉永善，2000），具有重要的藥用價值，在醫藥和保健品產業中被廣泛使用（Vahid et al.，2004）。沙棘黃酮能夠增強心臟收縮和舒張功能，具有抗心率失常、抗心肌缺氧缺血、增強免疫、降低血清膽固醇，同時還具有抗腫瘤、老化和消炎等廣泛的藥理功效（廉永善，2000；Gupta et al.，2006；Mishra et al.，2008；Geetha et al.，2009）。黃酮物質主要以苷元的形式存在于沙棘屬植物的葉子和果實中（Chen et al.，2013）。以往對中國沙棘和西藏沙棘葉片黃酮的研究表明：兩種沙棘葉在黃酮成分組成上差異較小，總黃酮由以楊梅素（Myrica）、槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和異鼠李素（Isorhamnetin）為主要苷元的數十種黃酮苷類化合物所組成（Vahid et al.，2004；秦振嫻等，2016；洪道鑫等，2017）。槲皮素是人類營養譜中的一個主要的糖苷配基，被認為是一種有效的自由基清除劑，對幾種類型的癌癥和心血管疾病具有藥理功效（Knekt et al.，2002）。山奈酚具有強抗氧化性，可降低冠狀動脈心臟疾病的風險（Kim et al.，2008）。異鼠李素在人心血管疾病方面亦具有療效（Ibarra et al.，2003）。

沙棘葉片中總黃酮的組成和含量會受到生長環境的影響，藥材品質亦會受到間接影響（蘇錦松等，2017）。然而，目前沒有學者系統地研究過西藏沙棘黃酮組成和含量與環境因子的關系。鑒于上述原因，本研究以西藏沙棘葉片為研究材料，借助高效液相色譜（RP-HPLC）檢測技術，測定4種主要黃酮含量，研究黃酮含量與生態因子的關系，以揭示影響西藏沙棘葉片黃酮含量的主要生態因子。

1 材料與方法

1.1 樣地設置

根據西藏沙棘在青藏高原的自然分布情況，選取了 26個自然種群作為樣地，整個樣地位于青藏高原東南部，包括甘肅、青海省、四川3個省區，地理位置為緯度 31°～38°N，經度 99°～103°E，海拔2890～4046 m（圖 1）。

1.2 樣品的采集

于2011年8月進行植物樣品的采集，在每個樣地選取30個個體，每個個體采集5片葉片，葉片均向陽成熟且生長良好，沒有病、蟲斑。

1.3 樣品的測定

1.3.1 儀器和試劑

美國Agilent 1100高效液相色譜儀，由自動脫氣系統、全自動進樣器、四元泵、紫外可變波長檢測器、Chem stations色譜工作站組成。RE-52AA型旋轉蒸發器（上海雅榮生化設備儀器有限公司），AR-2140型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），KQ-160TDE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHB-III型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。HPLC用Fisher公司生產的色譜純甲醇試劑，水為雙蒸水；其余所用試劑均為分析純。

1.3.2 對照品

楊梅素（529-44-2，純度98%）、槲皮素（批號117-39-5，純度98%）、山奈素（批號520-18-3，純度98%）和異鼠李素對照品（批號480-19-3，純度98%）。

1.3.3 色譜條件

美國 Agilent 1100高效液相色譜儀，Welch Ultimate?AQ-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長370 nm；柱溫25 ℃；流動相由甲醇（A）、乙腈（B）、0.1%磷酸溶液組成（C），采用梯度洗脫，運行時間 24 min；進樣量 10 μL，流速為 1 mL·min-1。其梯度洗脫條件如下：0～10 min，12% A，20% B，68% C；10～18 min，52% A，48%C；18～24 min，72% A，28% C。在此色譜條件下，樣品中各組分的色譜峰分離度良好。

1.3.4 供試樣品溶液的制備

圖1 本研究西藏沙棘采樣點Fig.1 Sampling sites of Hippophae tibetana Schlecht. in this study

取適量冷藏的沙棘葉片樣品，在研缽中磨細，并過100目篩。在50 ℃下真空干燥4 h。稱取1 g沙棘細粉于50 mL三角瓶中，加入30 mL 70%甲醇，在功率為80 W、水溫為30 ℃的條件下超聲提取30 min，提取液冷卻至室溫后進行抽濾，重復 3次，合并濾液。在旋轉蒸發儀上濃縮濾液精密量取濾液15 mL于 100 mL圓底燒瓶中，加入 22.5 mL 2 mol·L 鹽酸，在95 ℃條件下加熱回流45 min后冰浴，冷卻后加入11.25 mL異戊醇（Isoamylalkohol，IAA）進行萃取，劇烈晃動，使上相和下相分離，用移液槍吸取上相液體（含有水解的黃酮類物質），甲醇定容于50 mL容量瓶中，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試溶液（Zhang et al.，2005；Zu et al.，2006）。

1.3.5 標準曲線的制作

分別稱取10 mg槲皮素、2.5 mg山奈素和10 mg異鼠李素、1 mg楊梅素對照品于燒杯中，用甲醇溶解并轉移至50 mL容量瓶中，定容，分別配得0.2、0.05、0.2、0.02 mg·mL-1對照品溶液，然后進行濃度梯度稀釋。吸取 10 μL進樣，以進樣濃度（mg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，對照品槲皮素、山奈酚、異鼠李素和楊梅素進樣濃度-峰面積均呈良好的線性關系，結果見表1。

1.4 氣象數據獲取

根據每個采樣點的地理坐標，從全球氣象數據庫（http://www.worldclim.org）獲取（Hijmans et al.，2005）氣象數據，主要包括年均溫度、年均降雨量、年平均最低溫、年平均最高溫、風速、1月平均溫度、7月平均氣溫、水蒸汽壓。

1.5 數據分析

運用SPSS（IBM，Chicago，IL，USA；2008）對西藏沙棘葉片黃酮平均值、分布范圍、變異特征和正態分布進行統計分析。運用Canoco 4.5軟件中的冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）方法分析西藏沙棘葉片黃酮含量與生態因子之間的相互關系。顯著度水平設為0.05。

2 結果

2.1 西藏沙棘葉片黃酮含量特征

西藏沙棘葉片中楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均含量分別為(0.13±0.07)、(2.00±0.50)、(1.08±0.29)、(3.51±0.54) mg·g-1。葉片楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均含量排序為：異鼠李素＞槲皮素＞山奈酚＞楊梅素（見表2、表3）。

2.2 西藏沙棘葉片黃酮含量與氣候因子的關系

不同種群沙棘黃酮含量與生態因子 RDA排序（如圖 2所示）結果顯示，第一和第二主軸分別解釋了西藏沙棘黃酮變量57.6%和2.3%的方差。圖中箭頭越長，表示對黃酮含量的解釋量越大。箭頭之間的角度代表了變量間的相關性。因此，西藏沙棘總黃酮、異鼠李素、槲皮素和楊梅素含量與海拔（F=9.723，P=0.006）、1 月氣溫（F=5.525，P=0.014）、年均降雨量（F=5.425，P=0.022）、水蒸汽壓（F=3.682，P=0.048）呈現顯著正相關關系，而與年平均最低溫（F=3.621，P=0.06）、年均溫度（F=3.279，P=0.074）、年平均最高溫（F=2.800，P=0.096）和7月氣溫（F=0.753，P=0.424）呈不顯著正相關關系；與緯度（F=8.632，P=0.004）、風速（F=2.830，P=0.090）呈負相關關系；而西藏沙棘葉片山奈酚對生態因子的響應不同于其他3種黃酮，與經度呈負相關關系（F=0.301，P=0.692）。

3 討論

本研究采用化學成分分析和冗余分析統計方法探索了26個西藏沙棘種群4個黃酮成分對8個生態因子的響應，明確了影響西藏沙棘葉片總黃酮、異鼠李素、槲皮素和楊梅素含量的主要因素依次是海拔、1月氣溫、年均降雨量、水蒸汽、緯度；而山奈酚隨生態因子無顯著的變化規律。

表1 4種對照品的標準曲線Table1 Standard curve of four reference substances

表2 西藏沙棘葉片楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素和總黃酮含量Table2 Leaf myrica, quercetin, kaempferol, isorhamnetin, total flavonoid content in Tibetan sea-buckthorn

表3 不同種群西藏沙棘葉片黃酮質量分數Table3 Leaf flavonoid content in different Tibetan sea-buckthorn populations

圖2 不同種群沙棘黃酮含量與生態因子RDA排序圖Fig.2 RDA of flavonoid content and environment variables in different Tibetan sea-buckthorn populations

黃酮是一類植物重要的次生代謝產物，是植物在長期演化過程中形成的，并在防御病原體，抵御食草動物和環境脅迫方面起著重要的作用（Carlsen et al.，2008；Agati et al.，2011）。環境因素，如氣候和光照能夠決定植物的生長，并影響著植物體內黃酮的成分和含量（Ksouri et al.，2008；Murai et al.，2009）。因此，植物體內黃酮類化合物的組成和含量高度可塑，與其生長環境密切相關（Susanne et al.，2010）。

海拔對植物體內黃酮的累積起著重要作用，例如，不同海拔的中國沙棘葉片黃酮含量與海拔呈顯著正相關關系（蘇錦松等，2017）。海拔是一個影響植物生長發育和分布的間接因素，隨著海拔的升高，氣候逐漸變得惡劣，降水增多，年均溫度下降，而輻射增強，其中以水分、溫度和紫外輻射等生態因子對植物的生長發育影響最為顯著（祝青林等，2005）；本研究結果表明，高海拔地區西藏沙棘葉片富含較多的黃酮，說明惡劣的環境條件有利于西藏沙棘葉片黃酮的富集。諸多生態因子中，目前已有研究證實：黃酮類物質如槲皮素、楊梅素、山奈酚和異鼠李素以及花青素可以充當紫外吸收物質，具有防輻射功能，尤其是在葉表皮細胞中的積累，可以保護葉片內部組織，減少UV-B損傷（Nybakken et al.，2004；Treutter，2006），葉黃酮的累積可以提高自身的適合度；槲皮素、山柰酚、異鼠李素和楊梅素是西藏沙棘常見的黃酮苷元（秦振嫻等，2016），它們的衍生物主要以糖苷的形式存在于西藏沙棘葉片細胞的液泡中。為了更好地適應當地惡劣的環境，必然分配大量的資源用于葉片黃酮的合成以充當UV-B的吸收物質，而不用于植物生長和繁殖。

1月氣溫高低影響著西藏沙棘的生長發育，進而影響葉黃酮累積，它是一個限制因素；而年均降水量最主要的決策因素，降水量的多少很大程度決定著土壤蒸發量和植物蒸騰作用的強弱，充足的水分供給是西藏沙棘維持正常生長發育和生理活動的重要保障，也是葉片次生代謝產物積累的前提條件。蘇錦松等（2017）對同屬植物中國沙棘葉片黃酮的研究表明：雖然影響中國沙棘葉片槲皮素、異鼠李素、山柰酚生態因子各有差異，但是總體都以海拔和降雨量占主導，這與本文部分研究結果一致。

4種黃酮苷元中，槲皮素、楊梅素和異鼠李素含量隨空間和氣候因子顯示出一致的變化規律，但是山奈酚含量沒有表現出任何規律。Ryan et al.（1998；2014）發現模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和牽牛花（Pharbitis nil）對UV-B輻射的響應和其他植物有差異，隨著UV-B輻射逐漸升高，植物體內槲皮素/山奈酚的比率呈變大趨勢，由此推斷，槲皮素對UV-B輻射比山奈酚敏感，槲皮素對UV-B輻射更高效。西藏沙棘葉片山奈酚含量隨空間和氣候因子無顯著規律，可能是由山奈酚對UV-B輻射響應的差異造成的，這有待進一步驗證。

4 結論

西藏沙棘葉片楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均含量分別為 0.13、2.00、1.08、3.51 mg·g-1。西藏沙棘葉片總黃酮含量與海拔、1月氣溫、年均降雨量和水蒸汽壓呈顯著正相關關系；與緯度呈顯著負相關關系；說明高海拔地區有利于西藏沙棘葉片黃酮的富集。山奈酚與槲皮素、楊梅素和異鼠李素對生態因子的響應不一致。

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