發酵乳清蛋白制備抗氧化肽工藝的優化

文/胡姝敏 劉寶華 孫欣瑤 李曉東 王春潮

（1 黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司；2 東北農業大學食品學院）

抗氧化劑在國內外發展較快，在越來越廣泛的領域進行應用。Harman提出的自由基理論指出，過多的自由基會造成細胞受損害，如磷脂膜、蛋白損害和DNA損害，這和一些疾病息息相關，如肥胖癥、動脈粥樣硬化、癌癥等[1～3]。人們也有這樣的意識，即人體內因氧化產生的自由基是導致人衰老和部分疾病的原因[4]，抗氧化劑應用范圍廣，不僅可以用于食品中以延長保質期，而且可用于保健食品及化妝品中作為功能成分。抗氧化劑有繁多的種類，但是化學合成的抗氧化劑如BHA、BHT等使用受限，其使用不當可以引起DNA損傷，且本身具有毒副作用[5，6]，為增加安全性，很多國家對抗氧化劑的添加量都規定了ADI值[7]。因此，人們逐漸開始研究提取天然抗氧化劑，主要是從植物、動物組織中提取，已研制出乳清蛋白肽、大豆多肽及肌肽等，根據其不同的功能性應用于不同的產品中，如抗氧化肽、降膽固醇肽、降血壓肽、抗菌肽[8]等。活性肽是對機體健康有影響的特殊蛋白質片斷，對促進機體健康，防御疾病功能具有積極作用[9]，能使機體組織損傷降低到最小，其功能主要取決于所含的氨基酸組成和序列，可以添加到功能性食品或特殊的營養應用中[10]。

發酵方法相比于蛋白酶解法有其獨特的優點，微生物產酶的過程和酶水解蛋白的過程結合為一步，酶的分離和產物純化步驟被省去，生產成本也隨之降低。微生物產生的端肽酶對活性肽末端起到修飾的作用，因此小肽不但苦味降低，同時還有發酵產生的天然芳香味，有較好的適口性[11]。抗氧化肽能有效地清除體內累積的自由基生物活性物質，有效保護細胞及組織的生理功能。氧化與人類及其它動物的許多疾病相關[12，13]，例如癌癥、衰老、心腦疾病等，適當攝入具有抗氧化活性的物質會起到預防疾病的作用。抗氧化肽能避免脂質過氧化的發生，減緩油脂的氧化速率，延長產品的保藏期。通過對抗氧化多肽的研究開發，能夠為更多領域提供更安全、更可靠、抗氧化活性更高的抗氧化劑，為抗氧化多肽的進一步研究提供依據，相信抗氧化多肽會有一個更廣闊的應用前景。本研究主要是確定發酵菌種和優化抗氧化多肽發酵工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株：瑞士乳桿菌（lactobacillus Helveticas）CICC22818、CICC22815，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）20538、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）22173、23119，來自東北農業大學食品學院重點試驗室菌種保藏庫。

乳清濃縮蛋白（WPC80）：湖北欣和生物科技有限公司提供；DPPH：Sigma公司；甘氨酸：天津博迪化工股份有限公司；茚三酮：天津市科密歐化學試劑開發中心。

1.2 儀器與設備

JD500-2電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；85-2恒溫磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；數顯恒溫水浴箱：上海比朗儀器有限公司；離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UT-1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司。

表1 甘氨酸標準曲線的制作

2 試驗方法

2.1 菌株的篩選

2.1.1 產酸能力的測定

使用PHS-3C精密pH計進行測定。pH計使用前應分別使用pH值為4.01和6.88的標準緩沖溶液（20 ℃）進行校準。

2.1.2 活菌數的測定

在無菌操作下取5mL發酵樣品，加入45 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，然后根據樣品中含菌量的不同，做10 倍系列不同濃度稀釋，取適當梯度的稀釋液倒在MRS瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養72 h，對菌落數進行計數（以每mL樣品中的菌落數進行計數）。

2.1.3 水解度的測定

水解度的測定[14]采用茚三酮顯色法，用甘氨酸的量計算。原理為：蛋白質水解物和茚三酮發生顯色反應生成藍色物質，用分光光度計進行測定。

（1）甘氨酸標準曲線的繪制

準確稱取0.1g干燥的甘氨酸，溶解定容至100 mL容量瓶中，再吸取2.00 mL溶液定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為20 μg/mL的溶液。再以此溶液分別稀釋成甘氨酸含量為2～20 μg/mL的溶液用于繪制標準曲線（表1）。取稀釋液2.00 mL于試管中，加入1.00 mL顯色劑，混勻后沸水浴中加熱15 min，同時作空白試驗，冷水冷卻后，加入5.0 mL 40%（V/V）乙醇溶液混勻，并放置15 min，用空白組在570 nm處調零，測定試驗組的吸光值。（2）茚三酮顯色劑的配制

2 g茚三酮溶解于100 mL蒸餾水中，溶液置于棕色瓶中保存，現用現配。

（3）茚三酮法測定蛋白水解度

取蛋白水解液0.5 mL定容至50 mL容量瓶中，再從中取0.40 mL稀釋液于試管中，用蒸餾水稀釋5倍，加入1.00 mL茚三酮溶液，混勻后沸水浴15 min，同時作空白試驗。根據測得的吸光度計算乳清濃縮蛋白水解度。

計算蛋白水解度公式如下：

其中：htot是指每克被裂解蛋白質的肽鍵毫摩爾數，WPC htot=8.8（mmol/g）；6.25×N為乳清蛋白含量（g/L），采用凱氏定氮法進行測定。

2.2 乳清蛋白抗氧化肽制作工藝的優化

2.2.1 單因素試驗

（1）乳清蛋白含量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉〔6%、8%、10%、12%、14%（W/V）〕，用去離子水配制，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，并按照2%的比例接種瑞士乳桿菌CICC 22818，在恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，于6 000 rpm條件下離心15 min，測定蛋白水解度，以蛋白水解度為指標，并測定不同濃度的乳清濃縮蛋白對DPPH自由基清除能力的影響。

（2）發酵時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉，加入去離子水配制成濃度為10%（W/V）的溶液，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，并按照2%的比例接種瑞士乳桿菌CICC 22818，在恒溫培養箱中37 ℃條件下分別培養24、36、48、60、72 h，取20 mL加入離心管中，6 000 r/min離心15 min，測定蛋白水解度和DPPH自由基清除能力，研究發酵時間對蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響。

（3）接種量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉，加入去離子水配制成濃度為10%（W/V）的溶液，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，瑞士乳桿菌CICC 22818接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，在恒溫培養箱中37 ℃條件下分別培養24 h，取20 mL加入離心管中，6 000 r/min離心15 min，測定蛋白水解度和DPPH自由基清除能力，研究接種量對蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響。

（4）發酵溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉，加入去離子水配制成濃度為10%（W/V）的溶液，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，并分別按照2%比例接種瑞士乳桿菌CICC 22818，在恒溫培養箱中在37、40、43、45、50 ℃條件下分別培養24 h，取20 mL加入離心管中，6 000 r/min離心15 min，測定蛋白水解度和DPPH自由基清除率，研究溫度對蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響。

2.2.2 乳清濃縮蛋白發酵測定指標

（1）水解度

測定方法見2.1.3。

（2）DPPH自由基清除能力

參考Shimada等[15]的方法進行測定，原理為DPPH在乙醇中呈紫色，于517 nm處有強吸收能力，加入抗氧化劑后會褪色，其顏色變淺程度可反映抗氧化劑的抗氧化能力。將 DPPH用無水乙醇配成濃度為6.5×10-4mol/L的溶液，在冰箱存放，用時稀釋為6.5×10-5mol/L溶液。將1.0 mL 5.00 mg/mL蛋白水解液加入到2.0 mL DPPH溶液中，避光保存30 min后在517 nm處測定樣品吸光值。吸光值越低其抗氧化性越強。

2.2.3 抗氧化肽制備工藝的優化

選擇發酵濃度、發酵時間、接種量、發酵溫度為變量，選定四因素三水平，Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設計，采用響應面分析法分析試驗，以DPPH自由基清除能力為指標，對抗氧化肽工藝參數進行優化，并做驗證試驗。

2.3 乳清蛋白肽抗氧化性的測定

瑞士乳桿菌CICC 22818發酵乳清濃縮蛋白WPC 80，在最佳發酵條件下，即發酵溫度為43 ℃，發酵時間為60 h，接種量為3%，乳清蛋白濃度為10%時，以水解液的·OH自由基清除能力、還原力為指標，測定蛋白發酵液的抗氧化能力，并與未優化發酵條件的蛋白水解液對比抗氧化能力，檢測抗氧化性提高的情況。

2.3.1 ·OH自由基清除能力的測定

根據賈之慎等[16]方法對·OH自由基清除能力進行測定。先取一定量的樣品，用磷酸緩沖溶液進行溶解。取0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL于試管中，加入0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.4）2 mL和蒸餾水1 mL，混勻后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液和1 mL雙氧水，37℃水浴60 min，測得損傷管吸光值A損。未損傷管以蒸餾水代替損傷管中的雙氧水，方法同上，測定未損傷管的吸光值A未。樣品管用樣品代替損傷管中的蒸餾水，在536 nm處測吸光值。按下列公式計算清除率。

2.3.2 還原力的測定

根據Oyaizu[17]方法對還原力進行測定。取一定質量濃度的乳清蛋白水解產物樣品溶液1.00 mL，加入2.00 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）和1%鐵氰化鉀溶液各2.50 mL，50 ℃水浴20 min，然后加入質量分數為10%的三氯乙酸2.50 mL，3 000 r/min條件下離心10 min。取2.50 mL上清液和 0.50 mL三氯化鐵（0.1%，W/V）混合，10 min后在700 nm處測定吸光度A，A越大還原能力越強。

2.4 乳清濃縮蛋白發酵液的純化及凍干

2.4.1 超濾處理乳清濃縮蛋白發酵液

取乳清濃縮蛋白發酵液，在6 000 r/min條件下離心15 min，除去菌體及部分大分子物質。取上清液超濾去除大分子物質及鹽類等雜質，乳清濃縮蛋白發酵液使用10 Ku截留分子量薄膜進行超濾濃縮，超濾溫度為40 ℃，壓力為0.2 MPa，WPC濃度為10%。

2.4.2 乳清蛋白肽的冷凍干燥

先將多肽降溫使其凍結，然后用冷凍干燥機干燥樣品。具體操作如下：（1）取發酵得到的水解肽于專用平皿內，在冰箱中冷凍直到成固體為止。（2）將冷凍好的發酵水解肽放入冷凍干燥機內，設置溫度維持在-45 ℃，真空度設置為20 Pa。（3）冷凍干燥24 h后取出。

2.5 數據處理

每個試驗重復三次，結果表示為平均數±SD。數據統計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（p＜ 0.05）分析使用Tukey HSD程序。采用sigmaplot12.5軟件作圖。

3 結果與分析

3.1 菌種篩選指標的研究

3.1.1 水解度

如圖1所示，以甘氨酸為標準物質建立吸光值y與游離氨基含量x之間的標準曲線，得到回歸方程為：y=0.04x+0.0015（R2=0.9992），線性良好，可用于計算乳清蛋白水解度。

3.1.2 乳清蛋白水解度

圖1 蛋白質水解度標準曲線

圖2 不同菌株的蛋白水解度測定

圖3 不同菌株在不同發酵時間的pH值測定

圖4 不同發酵時間菌活力的測定

圖5 發酵期間CICC 22818的數量變化

不同菌株的蛋白水解度的測定結果如圖2。由圖可知，不同類型的菌株對乳清蛋白的水解能力有差別，在相同的條件下，菌株CICC 22818對乳清蛋白的水解能力最強，72 h內，蛋白水解度隨著時間的延長逐漸增加。蛋白水解度關系到蛋白質分解成小肽段的程度，對后續抗氧化肽的測定會有影響，應優先考慮水解蛋白能力強的菌株，因此選擇瑞士乳桿菌CICC 22818。

3.1.3 產酸能力

不同菌株在不同發酵時間的pH值的測定結果如圖3所示，由圖可知，在發酵一段時間后，各個菌種在發酵過程中，隨著培養時間的延長不斷產酸，使得發酵液的pH值不斷下降，菌株的產酸能力逐漸增加，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）CICC 22815和CICC 22818的pH值很接近，產酸能力較強，pH值降低得最多，最后可達到3.97左右。其它菌株pH值也有相對的降低，但是幅度較小。

3.1.4 發酵過程中的菌活力

不同菌種不同發酵時間菌活力的測定結果如圖4所示，可以看出，不同的菌種發酵不同的時間檢測菌種的存活情況，菌種在發酵24 h有較強的活力，隨著發酵時間的延長，菌種的活力均逐漸下降，其中菌種CICC 22818在發酵乳清濃縮蛋白72 h仍保持8.5 LogCFU/g，顯著高于其它菌株。因此本試驗選擇瑞士乳桿菌CICC 22818作為試驗菌株。

3.1.5 瑞士乳桿菌CICC 22818的生長曲線

在乳清蛋白發酵期間內，定期取樣，測定其中瑞士乳桿菌CICC 22818的活菌數變化。結果如圖5所示，在發酵12 h時，CICC 22818的活菌數達到9.17 LogCFU/g，隨后在24 h時略有提高，可以達到9.2 LogCFU/g，之后在24～48 h內活菌數又有所下降，但是下降幅度不明顯（P＞0.05），48 h后CICC 22818數量一直呈下降趨勢，但是84 h時活菌數仍接近8.45 LogCFU/g。

3.2 乳清蛋白抗氧化肽制備工藝的優化

3.2.1 乳清蛋白發酵條件單因素試驗

（1）發酵溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖6可知，隨著發酵溫度的升高，蛋白水解度呈現先上升后下降的趨勢，瑞士乳桿菌CICC 22818發酵作用需要在一定溫度范圍內進行，高溫或低溫都有礙反應進行，45 ℃時水解度達到最大。在最適溫度45 ℃時，DPPH自由基清除率也最高。隨著溫度的升高，菌活力會有所下降，蛋白質裂解的肽鍵數減少，水解度緩慢下降，小分子肽也隨之減少，清除自由基能力受到限制。綜合蛋白水解度和DPPH自由基清除率，選取43～50℃為最佳溫度范圍，并進行后續的優化試驗。

圖6 發酵溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖7 菌株接種量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖8 乳清蛋白含量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

在瑞士乳桿菌適應的溫度范圍內，菌株活力不受影響，乳清蛋白發酵過程中水解能力不受影響，并且隨著溫度的升高，蛋白水解能力增強，隨著蛋白水解程度的增加，乳清蛋白分解成小分子肽的量也逐漸增多，使得具備抗氧化能力的多肽對DPPH自由基的清除能力增強。

（2）接種量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖7可知，隨著瑞士乳桿菌CICC 22818接種量的增加，乳清濃縮蛋白的水解度在發酵期間逐漸增大，原因是隨著菌株接種量的增加，菌體本身含有的酶的量也隨之累積，水解度也就相應提高。但當菌株接種量大于3%（V/V）時，隨著菌株接種量的增加，蛋白水解度逐漸減少。這主要是由于當菌株接種量太低時，菌種活力低，因此蛋白分解能力差；當添加量增加時，活菌數增加，在發酵過程中菌體細胞中的蛋白酶因菌體自溶而被釋放出來，因此加快了蛋白質水解，使得蛋白質被更多地分解成多肽，清除DPPH自由基能力的抗氧化肽量也增多。但當菌株接種量過多時，產酸速率也相應加快，較高的酸度環境會抑制菌種蛋白酶的活力，從而使得蛋白質水解度降低，抗氧化肽含量減少，清除自由基能力變小。

（3）乳清蛋白含量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖8可知，隨著乳清蛋白含量的增加，水解度先增加后減少，在8%達到最大。底物濃度剛開始小，而菌的分解能力較強，使得底物供不應求，所以水解度小，分解得到的多肽量也少；當濃度達到一定時，菌在發酵時快速分解，底物與菌產生的酶等比發生反應，水解度變大，自由基清除能力也增強，在蛋白濃度10%（M/V）左右時達到最大；當底物濃度過高時，反應物小于底物濃度，菌株不能使蛋白完全分解，水解度下降。

（4）發酵時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖9可知，隨著發酵時間的增加，蛋白水解度先逐漸增大后減小，這主要是由于在一定發酵時間范圍內，菌株的活性增強，蛋白質水解能力較強，而當發酵時間繼續增加，菌株產酸越多，較低的pH值環境降低了菌株的酶活性，導致蛋白水解量降低[18]。而在此過程中，隨著蛋白水解能力的增強，自由基的清除率也逐漸增加，但隨著時間的增加而越來越緩慢，這可能是由于蛋白水解到一定程度后，蛋白質分解成小分子肽的速度變慢，使具有抗氧化能力的肽量也增加較慢。

3.2.2 BOX-Behnken優化發酵工藝參數

本試驗選擇接種量（A）、發酵時間（B）、溫度（C）、乳清蛋白含量（D）四個因子為自變量，以DPPH自由基清除率為響應值，在單因素試驗的基礎上進行四因素三水平的響應面設計，建立BOX-Behnken模型，見表2。BOX-Behnken試驗設計及試驗結果見表3，響應值R表示DPPH自由基清除率。

圖9 發酵時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響

可以得出該試驗的擬合方程為：

此方程式中，R為DPPH自由基清除率預測值，A、B、C和D分別為接種量、發酵時間、溫度和乳清蛋白含量的編碼值。對得到的四元二次回歸方程進行方差分析和系數顯著性檢驗，結果見表4。

該模型中p＜0.001，表明本研究所得的回歸模型方程極顯著，相關系數R2=93.40%，說明該回歸方程的回歸效果較好，預測值與真實值之間具有高度相關性，DPPH自由基清除率的實測值與預測值兩者之間擁有較好的擬合度。變異系數（CV）用于反映模型的置信度，CV值和置信度呈反比的關系，其值越低表示模型的置信度越高，本試驗模型中CV值為6.17%，說明此設計的模型可以較真實地預測試驗結果；失擬項P=0.7224＞0.05，表明不顯著，可以用該響應面設計有效表示各因素之間的關系。模型的校正決定系數=86.79%，表明DPPH自由基清除率可以由該響應面設計來解釋。綜上所述，該回歸方程的擬合度和可信度均較好，此方法可靠，可用于 DPPH自由基清除率的預測。

響應面的優化作用可以反映溫度、發酵時間、接種量和乳清蛋白含量對DPPH自由基清除率的影響，除此之外還能顯示兩個變量之間是否具有交互影響。由上表顯示，模型方程的一次項x3的P值小于0.0001，說明接種量對DPPH自由基清除率的影響極顯著，x1、x2的P值0.0091、0.0010均小于0.05，說明發酵時間和溫度對DPPH自由基清除率有顯著影響，x4的P值為0.0811＞0.05，差異不顯著。各因素對DPPH自由基清除率影響作用大小按次序依次是C＞B＞A＞D，即溫度＞發酵時間＞接種量＞乳清非常顯著，說明DPPH自由基清除率和各變量之間并不是線性關系那么簡單，回歸方程模型項P值小于0.001，所以該模型非常顯著。各因素間兩兩互作對DPPH自由基清除率的影響響應面圖如圖10所示。

如圖10所示，由相應響應面設計圖可以直觀地看出四種因素中每兩種因素交互作用對DPPH自由基清除率的影響不顯著。對比所有響應面圖可知，圖10（4）交互的等高線最密，響應面最陡，同時二者交互影響的F值大于其它因素兩兩交互影響的F值，且P值最小，因此二者交互作用對DPPH自由基清除率的影響最大。除此之外，發酵時間和乳清蛋白質量分數的交互作用最小；如圖10（5）所示，曲面較平緩，同時方差分析得到二者交互作用的F值最小，說明二者交互作用對自由基清除率的影響最小。因此各因素間交互作用可以忽略不計。上圖呈現情況與方差的分析結果一致。

表2 乳清蛋白發酵BOX-Behnken因素水平設計

表3 DPPH自由基清除率的BOX-Behnken 試驗設計及結果

表4 試驗設計方差分析

圖10 各因素交互作用的響應曲面圖

3.3 最佳抗氧化肽制備工藝驗證試驗

用模型的回歸方程求導數方程，并計算此導數方程的解，算出模型的最高點即最佳值，經響應面分析得出DPPH自由基清除率的四個因素的最佳水平值是發酵時間63 h、接種量3.4%、發酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白濃度9.86%，響應面最值的DPPH自由基清除率為26.4 %。為驗證模型預測的可靠性，將響應面設計優化后的結果與實際值比較，按照上述優化后參數進行驗證試驗，得到DPPH自由基清除率的實際值，將最佳條件修改為接種量3.5%、發酵時間63 h、發酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白含量10%。驗證試驗最終顯示，DPPH清除率實際值為（27.52±0.26）%，實際值與預測值相差較小，證明該模型重現性好，進一步驗證了模型的可靠性。

為了得到較高的DPPH自由基清除率，本試驗對主要影響因素進行單因素試驗，在單因素的基礎上選取各因素的試驗水平，通過響應面設計得到DPPH自由基清除率的最優參數為接種量3.5%、發酵時間63 h、發酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白含量10%。

3.4 乳清蛋白肽抗氧化性的測定

自由基清除能力和鐵離子還原能力可以顯示瑞士乳桿菌發酵乳清蛋白得到的抗氧化鈦的抗氧化活性。發酵乳清蛋白制備的抗氧化肽純化并干燥后，對DPPH和·OH自由基的清除能力及還原能力分別為35.62%，20.58%，A=0.384。Liu等[19]以kefir發酵豆奶，發現發酵可顯著增強豆奶的抗氧化活性，他們認為在發酵過程中蛋白質降解為小分子的肽，從而增強了豆奶的抗氧化活性。Virtanen等[20]以多種乳酸菌發酵制備酸奶，結果表明發酵產品的抗氧化能力與其中蛋白質的水解度成正比。此外，在發酵過程中產生的氨基酸、乳酸及抗氧化性維生素都可增加蛋白質的抗氧化活性。

4 結論

研究發現，相同發酵時間下，瑞士乳桿菌CICC 22818的菌株活力及蛋白水解能力較強，分別達到8.5 LogCFU/g、9.36%，為最適菌株。通過響應面優化試驗得出：在發酵乳清蛋白時，當溫度為43.3 ℃、發酵時間為63 h、接種量為3.5%、乳清蛋白含量為10%時，DPPH自由基清除能力最大達到26.4%，經驗證試驗得出實際值為（27.52±0.26）%。綜上所述，瑞士乳桿菌發酵CICC 22818乳清蛋白制備乳清蛋白肽的最佳工藝為：接種量3.5%、發酵時間63 h、發酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白含量10%。經純化后的抗氧化肽的DPPH自由基清除率顯著提高，可達到35.62%，另外·OH自由基清除率為20.58%，同時也具有一定還原能力。

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